La precisión y la usabilidad del punto.

Sep 24, 2023

npj Clean Water volumen 6, Número de artículo: 5 (2023) Citar este artículo

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El fluoruro geogénico contamina el agua de decenas de millones de personas. Sin embargo, muchos desconocen el contenido de fluoruro debido en parte a las deficiencias de los métodos de detección. Las pruebas de biosensores son un enfoque relativamente nuevo para las pruebas de calidad del agua que abordan muchas de estas deficiencias, pero nunca han sido probadas por no expertos en un entorno del "mundo real". Por lo tanto, buscamos evaluar la precisión y la facilidad de uso de un biosensor de fluoruro en el punto de uso mediante encuestas y pruebas de campo en el condado de Nakuru, Kenia. Las pruebas de biosensor clasificaron con precisión el fluoruro elevado (≥1,5 ppm) en el 89,5 % de las 57 muestras analizadas. La usabilidad también fue alta; todos los participantes pudieron usar la prueba e interpretaron correctamente todas las muestras menos una. Estos datos sugieren que las pruebas de biosensores pueden proporcionar datos precisos y significativos sobre la calidad del agua que ayudan a los no expertos a tomar decisiones sobre el agua que consumen. Un mayor escalamiento de estas tecnologías podría proporcionar nuevos enfoques para rastrear el progreso global hacia el Objetivo de Desarrollo Sostenible 6.

La contaminación del agua y las cargas sanitarias y económicas resultantes son un problema de salud global apremiante1. El Objetivo de Desarrollo Sostenible (ODS) 6 rastrea el progreso hacia la "disponibilidad y gestión sostenible del agua y el saneamiento para todos". El progreso hacia la meta 6.1 de los ODS, la proporción de humanos con "acceso universal y equitativo a agua potable segura y asequible" se rastrea principalmente utilizando datos sobre el acceso a la infraestructura de agua potable informados por las oficinas nacionales de estadísticas al Fondo de Emergencia para la Infancia de las Naciones Unidas (UNICEF) y el Programa Conjunto de Monitoreo (JMP) de la Organización Mundial de la Salud (OMS)2.

Las estimaciones actuales basadas en los datos del JMP indican que dos mil millones de personas en todo el mundo carecen de acceso a un servicio de agua potable gestionado de forma segura2, por lo que no estamos en camino de cumplir la meta 6.1 para 20303. Incluso esta estimación puede ser demasiado optimista ya que los datos actuales sobre la calidad del agua son limitados4 . Específicamente, menos de la mitad de los estados miembros de las Naciones Unidas tienen los recursos para generar datos de calidad del agua lo suficientemente sólidos como para impulsar la gobernanza3. Como tal, existe una necesidad reconocida de tecnologías de recopilación de datos de uso más amplio para rastrear la presencia de contaminantes del agua identificados por la OMS como prioritarios5, específicamente E. Coli, arsénico, nitritos y fluoruro6.

Se encuentran niveles peligrosos de fluoruro en las fuentes de agua utilizadas por decenas de millones de personas en todo el mundo7,8. La exposición a concentraciones de fluoruro por encima de 1,5 ppm (o 1,5 mg/L), el límite establecido por la OMS6, generalmente ocurre cuando las sales fluoradas naturales se filtran a los acuíferos subterráneos. Los niveles elevados de fluoruro en las aguas subterráneas ocurren en todo el mundo y son motivo de especial preocupación en el norte y el este de África, Oriente Medio y partes de América del Norte y del Sur9,10. Si bien la exposición al fluoruro por debajo de 1 ppm tiene beneficios para la salud, incluida la prevención de la caries dental11 y el tratamiento de los síntomas de la osteoporosis12, la exposición crónica a altos niveles de fluoruro tiene una serie de efectos adversos, en particular, la fluorosis dental y esquelética13. La fluorosis fragiliza los dientes y los huesos al unirse al calcio dentro de ellos y puede causar complicaciones de salud debilitantes de por vida14,15.

Uno de los mayores obstáculos para mitigar la exposición al fluoruro geogénico nocivo es la dificultad para identificar su presencia: el fluoruro en el agua es incoloro, inodoro e indetectable al gusto por debajo de 2,4 ppm16. Afortunadamente, es sencillo cuantificar con precisión los niveles de fluoruro en entornos de laboratorio utilizando técnicas como la cromatografía iónica o los electrodos de detección de iones7. Además, las sondas fluorescentes de vanguardia capaces de detectar niveles nanomolares de analito17,18,19 pueden ofrecer un método aún más simple para el análisis de muestras en laboratorio. Sin embargo, todas estas tecnologías requieren una infraestructura y experiencia significativas para operar, lo que requiere un enfoque centralizado para su uso. Un enfoque centralizado, a su vez, requiere que las muestras se recolecten en el campo y se envíen al laboratorio, lo que genera costos adicionales y restricciones logísticas en las pruebas y la comunicación de los resultados en las áreas potencialmente afectadas.

Actualmente existen tecnologías de punto de uso precisas para eludir algunas de estas limitaciones, pero tienen un valor limitado para los no expertos debido a su costo, complejidad y/o precisión6. Por ejemplo, los electrodos y fotómetros portátiles de detección de fluoruro pueden medir cuantitativamente los niveles de fluoruro en el agua en el sitio, pero cuestan de cientos a miles de dólares y requieren procedimientos de calibración y mantenimiento para su uso. Las tiras químicas en el punto de uso ofrecen otra alternativa fácil de usar que cuesta menos de USD 1,00 por prueba, pero son propensas a falsos negativos y con frecuencia no identifican ni siquiera niveles extremadamente altos de fluoruro20. Como tal, existe la necesidad de métodos precisos, simples y asequibles que puedan ser utilizados por personas no expertas para identificar con precisión las fuentes de agua con niveles de fluoruro ≥1,5 ppm en el punto de uso. Estas pruebas pueden ayudar a las personas a tomar decisiones sobre el agua que consumen y hacer un seguimiento del progreso global hacia el ODS 6.

Las tecnologías de biodetección sin células ofrecen una estrategia prometedora para el desarrollo de diagnósticos de calidad del agua precisos, simples y asequibles21. Los biosensores son sistemas de proteínas o ARN de origen natural en las células que detectan compuestos relevantes para la salud celular. Estos sistemas naturales funcionan uniendo interacciones a los ARN o proteínas que luego desencadenan la expresión de genes que a su vez pueden metabolizar o exportar el compuesto. Los biosensores sintéticos se pueden crear extrayendo estos sistemas naturales de la célula y reconfigurándolos para expresar genes informadores codificados genéticamente que conducen a una señal detectable visualmente para indicar la presencia del compuesto objetivo (es decir, cambio de color). Una fortaleza clave de estos sistemas es que operan como una reacción in vitro, fuera de una célula viva y, por lo tanto, no son organismos modificados genéticamente. Además, pueden liofilizarse y almacenarse, facilitando su fabricación y transporte hasta donde se necesiten. La rehidratación de las pruebas con muestras de agua permite que se utilicen como diagnósticos de calidad del agua en el punto de uso. Además, la producción de reactivos biosensores cuesta del orden de decenas de centavos por prueba (USD 0,73 por una prueba y un control positivo)22, incluso en un laboratorio (es decir, no a escala de producción). Esto los hace comparables favorablemente con los costos de las tecnologías implementables en campo de patrón oro (USD 0,89, Tabla complementaria 1).

Para la detección de fluoruro, se ha diseñado con éxito un mecanismo de detección de fluoruro natural de Bacillus cereus en un biosensor capaz de detectar niveles de fluoruro tan bajos como 1 ppm y se ha incorporado a una prueba de fluoruro en el punto de uso20. Esta prueba consiste en una reacción de biodetección liofilizada que, cuando se rehidrata con una muestra de agua de interés, produce un color amarillo visible en presencia de fluoruro en cuestión de horas (Fig. 1). Esta prueba de biosensor de fluoruro libre de células se probó inicialmente en campo en un estudio en Cartago, Costa Rica20, una región con niveles elevados de fluoruro geogénico debido a su proximidad al volcán Irazú, una fuente conocida de sales fluoradas23. En ese estudio, las pruebas se fabricaron en Illinois y se llevaron a bordo de un avión comercial al sitio de campo. Las pruebas de nueve fuentes diferentes de agua subterránea y superficial realizadas por un estudiante de doctorado revelaron que los controles positivos funcionaron en todos los casos, lo que confirma que la bioquímica básica de las pruebas era sólida para la fabricación, el transporte y el uso en el campo. Además, se encontró que dos muestras tenían niveles detectables de fluoruro. Aunque prometedor, este estudio estuvo limitado por la pequeña cantidad de muestras de campo analizadas y, lo que es más importante, por el hecho de que las pruebas fueron realizadas por un solo usuario con experiencia en técnicas de laboratorio y operación de prueba. Para evaluar la usabilidad, las pruebas deben ser utilizadas por no expertos y en un tamaño de muestra lo suficientemente grande como para calcular la sensibilidad y la especificidad.

Se prepara una reacción de detección, se liofiliza y luego se rehidrata con una muestra de interés. Se produce una reacción enzimática en presencia de fluoruro, que convierte un sustrato incoloro en la reacción en un producto amarillo.

Por lo tanto, exploramos la precisión y la usabilidad de las pruebas de fluoruro en el punto de uso diseñadas con bioingeniería en el condado de Nakuru, Kenia, una región con contaminación geogénica conocida por fluoruro24,25. Específicamente, buscamos evaluar la precisión de la prueba, evaluada por la capacidad de detectar correctamente los niveles dañinos de fluoruro (establecidos por la OMS como ≥1.5 ppm6) en comparación con la fotometría, un método estándar de oro (Objetivo 1). También probamos la usabilidad, evaluada por la experiencia del usuario informada con la rehidratación y la interpretación de las pruebas (Objetivo 2).

Encuestamos a un miembro de cada hogar participante para recopilar información sociodemográfica; fuentes de agua potable; conocimientos, actitudes y comportamientos sobre el fluoruro y la fluorosis; y experiencias con la inseguridad del agua en el hogar. Luego, caracterizamos la precisión de la prueba del biosensor al pedirle a cada participante que proporcionara hasta tres fuentes de agua domésticas y las probara con el biosensor en el punto de uso. Se realizó una segunda encuesta el mismo día con el mismo participante para evaluar sus experiencias con el uso y la interpretación de los resultados de la prueba del biosensor, y para determinar y compartir las concentraciones de fluoruro obtenidas utilizando un método estándar, es decir, fotómetro de fluoruro. La recopilación de datos se describe gráficamente en la figura complementaria 1.

Se recogieron un total de 90 muestras de agua de 52 participantes. La sociodemografía y el conocimiento, las actitudes y los comportamientos relacionados con el fluoruro y las experiencias con la inseguridad del agua estaban disponibles para los 52 participantes. El tamaño de la muestra disponible para evaluar la precisión de la prueba (Objetivo 1) y la interpretación (Objetivo 2) fue de 57 muestras de agua proporcionadas por 36 hogares. El número de muestras se redujo de 90 a 57 porque las condiciones de envío del primer lote de pruebas provocaron la degradación de las pruebas, lo que las hizo inadecuadas para evaluar la precisión y la usabilidad (consulte "Envío del kit de prueba al condado de Nakuru, Kenia").

El estudio incluyó participantes de una variedad de antecedentes educativos y laborales, tamaños de hogares y niveles de inseguridad hídrica (Tabla 1). La mayoría de los 52 participantes eran mujeres (73,1%), con una mediana de edad de 41 años. Aproximadamente la mitad de los participantes habían completado al menos algo de educación secundaria. Las ocupaciones de los participantes se dividieron en gran medida en tres categorías amplias: agricultura, pequeñas empresas, por ejemplo, puestos de mercado o desempleados. Los ingresos familiares mensuales oscilaron entre KES 0 y 9500 (mediana de USD 8,60). El tamaño medio del hogar era de 5 personas; casi la mitad de los hogares tenían niños menores de cinco años. Aproximadamente una cuarta parte de los hogares tenían inseguridad de agua (puntaje HWISE ≥12), es decir, luchaban por acceder de manera confiable al agua para satisfacer las necesidades domésticas básicas.

La mayoría de los participantes (73,1 %) conocían el fluoruro; generalmente se referían a él como una "sal" o "mineral" que se encuentra en el agua. Además, 7 participantes mencionaron que el fluoruro perjudica la salud dental y esquelética, de forma espontánea. Cuando se les preguntó, la mayoría de los participantes (90,4 %) identificaron correctamente algunos o todos los síntomas de la fluorosis y la relación causal entre los problemas de salud y la exposición al fluoruro. La mayoría de los participantes (71,2%) conocía al menos a una persona afectada por fluorosis.

Este conocimiento se contrasta con una falta comparativa de comprensión de cómo tomar medidas contra la exposición al fluoruro, con un 42,3 % de los participantes que informaron que no sabían cómo prevenir la fluorosis y un 34,6 % que no sabían cómo tratarla. . En particular, mientras que aproximadamente la mitad (48,1 %) de los participantes afirmaron correctamente que el uso de fuentes alternativas de agua y el tratamiento del agua eran métodos para prevenir la fluorosis, menos participantes (26,9 %) entendieron que la fluorosis solo se puede tratar con atención médica y dental. La respuesta incorrecta proporcionada con más frecuencia sobre la prevención y el tratamiento de la fluorosis fue cepillarse los dientes.

Aunque los participantes informaron que se esforzaron por evitar el fluoruro, la fluorosis no fue una preocupación importante; El 71,2% de los participantes informaron que nunca o rara vez se preocuparon por la fluorosis. De los 33 participantes (63,5 %) que informaron haber tomado precauciones contra la fluorosis, la mayoría (n = 27) informaron haber usado métodos que en general eran efectivos, incluido el uso de fuentes de agua que no se sabía que estuvieran contaminadas, la dilución del agua de pozo con agua de lluvia o el tratamiento de sus agua potable. Sin embargo, 5 participantes (9,6 %) informaron que hirvieron el agua potable, lo que no reduce el contenido de fluoruro. Las respuestas completas de la encuesta se pueden encontrar en "Disponibilidad de datos".

Se analizó un total de 57 muestras de 36 hogares para determinar la precisión de la prueba (Métodos, Tabla 2). La mayoría de estas muestras de agua procedían de perforaciones (49,1 %), captación de agua de lluvia (19,3 %) o pozos excavados protegidos (17,5 %). La mayoría de las muestras proporcionadas (84,2 %) se usaron para cocinar, beber o ambos, pero muy pocas (7,0 %) se trataron para reducir el fluoruro. Los puntos de agua no estaban ubicados lejos de los hogares; el tiempo medio para recolectar agua fue de aproximadamente 5 min, ida y vuelta.

Aunque los participantes estaban preocupados por los niveles elevados de fluoruro en solo 10 de las 57 muestras, el análisis de fluorímetro realizado por el personal de campo indicó que 45 tenían niveles de fluoruro ≥1,5 ppm (78,9%), lo que indica una alta prevalencia de fluoruro geogénico en el agua potable (Tabla 2 y Figura 2a). Los niveles de fluoruro medidos también fueron altos, con concentraciones medias y medianas de fluoruro de 6,0 y 5,8 ppm, respectivamente. La mayoría de las 12 muestras no contaminadas eran agua de lluvia (83,3 %), mientras que la mayoría de las 45 fuentes contaminadas procedían de pozos (53,3 %), pozos excavados protegidos (22,2 %) o agua de lluvia mezclada con agua de pozo (11,1 %) (Tabla complementaria 2 ).

a Distribución de las concentraciones de fluoruro en 57 muestras de agua, medidas con un fluorímetro. La línea discontinua roja indica la directriz de la OMS para niveles elevados, ≥1,5 ppm. b Imágenes representativas de resultados de pruebas verdadero positivo, falso positivo, verdadero negativo y falso negativo. Las fotografías están anotadas con concentraciones de fluoruro medidas por fluorímetro. c Una matriz de confusión de los resultados de las pruebas. "Real" se refiere a la clasificación por fluorímetro como positivo (≥1,5 ppm de fluoruro) o negativo (<1,5 ppm de fluoruro). "Predicho" se refiere al rendimiento de la prueba del biosensor. "Negativo" significa que no se observó ningún cambio de color, y "Positivo" significa que se veía un color amarillo. Los verdaderos positivos y los verdaderos negativos están sombreados en gris, mientras que los falsos positivos y los falsos negativos están en blanco. d Curva característica de funcionamiento del receptor derivada de las clasificaciones en el panel c. La sensibilidad se calcula como (verdadero positivo)/(verdadero positivo + falso negativo) y la especificidad se calcula como (verdadero negativo)/(verdadero negativo + falso positivo).

Seis horas después de que los participantes del estudio rehidrataran las pruebas del biosensor, el personal de campo clasificó el resultado como positivo para fluoruro si se observaba un color amarillo, y negativo para fluoruro si no se observaba ningún cambio de color. La comparación de estas observaciones con los resultados del fluorímetro permitió clasificar las pruebas como verdadero positivo (amarillo, con fluoruro medido ≥1,5 ppm), falso positivo (amarillo, fluoruro medido <1,5 ppm), verdadero negativo (incoloro, fluoruro medido <1,5 ppm) , falso negativo (incoloro, fluoruro medido ≥1,5 ppm) (Fig. 2b). La tabulación de estos resultados en una matriz de confusión reveló que las pruebas del biosensor clasificaron correctamente 51 muestras (89,5 %) y clasificaron incorrectamente 6 muestras (10,5 %) (Fig. 2c). Por lo tanto, la sensibilidad de la prueba fue del 93,3 % (95 % IC 81,7 % a 98,6 %) y la especificidad fue del 75,0 % (95 % IC 42,8 % a 95,5 %). El trazado de estos datos en una curva de funcionamiento del receptor reveló un área bajo la curva de 0,842 (Fig. 2d).

No identificamos patrones entre las muestras de agua clasificadas incorrectamente en términos de fuente de agua o tratamiento. Además, observamos que casi una quinta parte (n = 10, 17,5%) de las reacciones de control positivo no se activaron (Tabla complementaria 2). No observamos ninguna característica compartida entre las muestras con controles positivos fallidos. Además, algunas pruebas positivas verdaderas habían fallado en los controles, lo que indica que la falla del control positivo para una muestra determinada no se correlacionaba necesariamente con una clasificación incorrecta de la prueba.

Para evaluar la usabilidad, preguntamos a los 36 participantes que proporcionaron muestras de agua sobre la precisión (Objetivo 1) sobre sus experiencias con la rehidratación y la interpretación de las pruebas. Todos los participantes pudieron transferir agua con éxito al tubo PCR con una micropipeta (Fig. 3, izquierda), aunque dos usuarios (5,6 %) experimentaron alguna dificultad para dispensar el agua. Debido a las limitaciones de campo, especialmente la distancia de las casas de los participantes desde donde se alojaba el personal de campo, el personal de campo no pudo estar físicamente presente con todos los participantes para leer los resultados de la prueba después de 6 h, por lo que se pidió a algunos participantes que evaluaran si había hubo un cambio de color antes de que se completara la reacción (Fig. 3, derecha). Sin embargo, en el momento de la lectura, observamos un acuerdo entre los participantes y el personal de campo en sus evaluaciones de la presencia o ausencia de un color amarillo en todas menos una de las 57 muestras utilizadas para la evaluación de la interpretación de la prueba (98,2 %) (Disponibilidad de datos). No hubo diferencias en la usabilidad por ninguna característica sociodemográfica, ni por experiencias o conocimientos, actitudes y comportamientos sobre la fluorosis o la inseguridad hídrica domiciliaria.

Las dos actividades clave del usuario para operar las pruebas son la rehidratación de la prueba, en la que se utiliza una micropipeta para transferir una muestra de agua a un microtúbulo (izquierda) y la interpretación de resultados, en la que el usuario comprueba si ha aparecido un color amarillo (derecha).

En lo que es, según nuestro conocimiento, la primera descripción de la implementación y operación de campo de cualquier prueba de biosensor por parte de usuarios no expertos, encontramos que una prueba de biosensor de fluoruro en el punto de uso demostró una serie de características positivas. Para nuestro primer objetivo, fue preciso en la detección de fluoruro en condiciones de campo, clasificando correctamente el 89,5 % de las 57 muestras. La sensibilidad fue del 93,3 % y la especificidad del 75,0 %, de modo que el área bajo la curva característica operativa del receptor fue de 0,842, lo que significa que existe una probabilidad del 84,2 % de que la prueba prediga correctamente la contaminación por fluoruro por encima del límite de la OMS de ≥1,5 ppm. Los valores del área bajo la curva entre 0,8 y 0,9 se consideran generalmente "excelentes"26.

Para nuestro segundo objetivo, estas pruebas fueron muy útiles. Todos los participantes pudieron hidratar las pruebas, y solo hubo una prueba con una discrepancia entre el personal del estudio y la interpretación de los participantes entre las 57 muestras utilizadas para evaluar la interpretación de la prueba. En resumen, los participantes pudieron identificar correctamente las concentraciones de fluoruro relevantes para la salud pública en sus propias fuentes de agua domésticas, lo que sugiere que las pruebas eran eminentemente utilizables.

Estas pruebas satisfacen una gran necesidad insatisfecha para establecer el contenido de fluoruro del agua potable fuera de un entorno de laboratorio. En comparación con los métodos de laboratorio estándar de oro, la cromatografía iónica y los electrodos de detección de iones, este biosensor permite realizar pruebas de fluoruro sin necesidad de una infraestructura intensiva en recursos o personal capacitado. Incluso en comparación con las pruebas estándar de oro en el punto de uso, como los electrodos portátiles o el fotómetro de fluoruro utilizado en este estudio, el biosensor tiene un modo de operación más simple y un menor costo por muestra analizada. De hecho, a USD 0,73 por prueba (incluido un control positivo) fabricada a escala de laboratorio (Tabla complementaria 1), este método es financieramente competitivo con las tecnologías existentes; los costos podrían reducirse aún más mediante la ampliación.

En particular, estas pruebas revelaron una prevalencia mucho mayor de niveles elevados de fluoruro de lo esperado por los participantes. Esto sugiere que dichas pruebas podrían revelar fluoruro en otras áreas potencialmente afectadas por el fluoruro geogénico. También pueden ser útiles en encuestas a gran escala sobre la salud humana, el bienestar o la seguridad del agua, como las realizadas por el Banco Mundial, Gallup Poll y la Agencia de los Estados Unidos para el Desarrollo Internacional. También podrían ser valiosos en áreas donde la presencia de fluoruro está bien establecida, debido a su capacidad para medir la seguridad del agua después de que se toman medidas para eliminar el fluoruro. Por ejemplo, las pruebas del biosensor identificaron niveles peligrosos de fluoruro en las muestras de agua de pozo, incluso después de haber sido diluida con agua de lluvia para reducir el contenido de fluoruro.

La degradación del primer lote de pruebas destacó claramente que la precisión de los biosensores en el punto de uso es susceptible de sufrir daños por la exposición a temperaturas extremas. El despliegue masivo requerirá lograr una verdadera independencia de la cadena de frío aumentando la estabilidad de la temperatura del sensor. Esto es particularmente importante porque muchas regiones con problemas endémicos de contaminación de aguas subterráneas, por ejemplo, Kenia25, India27, Pakistán28, Bangladesh29 y otras, tienen climas cálidos. Una de las vías más prometedoras para aumentar la estabilidad de la temperatura es la adición de compuestos llamados lioprotectores que estabilizan el sistema tras la liofilización; algunas reacciones de expresión génica in vitro pueden mantener la integridad a 50 °C hasta por un mes cuando se complementan con lioprotectores apropiados, aunque no se han realizado estudios similares en reacciones de biodetección30. Por lo tanto, la optimización del proceso de liofilización para la estabilidad de la temperatura y la vida útil mejora sustancialmente la solidez del sensor, lo que garantiza datos precisos sobre la calidad del agua en las áreas donde más se necesita.

Además, la inclusión continua de reacciones de control apropiadas será importante para la precisión de la prueba. Además de indicar el fracaso de la prueba, las reacciones de control son importantes para controlar los cambios en el comportamiento de la reacción causados ​​por la variación de la temperatura ambiente. Si bien los cambios de temperatura no afectarían la sensibilidad ni la especificidad de las pruebas, afectarían la velocidad de reacción y, por lo tanto, el tiempo de detección. Se pueden utilizar otros enfoques para mejorar la precisión, como el desarrollo de enfoques de calibración que puedan controlar la variabilidad debida a los inhibidores de reacción que pueden estar presentes en algunas muestras31.

Hay varias vías prometedoras para mejorar la usabilidad de estas pruebas. Por un lado, el tiempo más corto para obtener resultados sería menos oneroso para los participantes, a quienes se les pidió que miraran el color de la prueba cada hora. Si surgen problemas con la ambigüedad del cambio de color en otros entornos, podrían resolverse utilizando indicadores colorimétricos y sustratos alternativos32 para generar resultados más vibrantes. Además, el desarrollo de herramientas especialmente diseñadas para rehidratar las pruebas liofilizadas y facilitar la interpretación de sus resultados mejorará sustancialmente la experiencia del usuario. Por ejemplo, las pruebas podrían incorporarse en un ensayo de flujo lateral33, como los que se utilizan en las pruebas de embarazo caseras, para una mayor claridad de interpretación. Las pruebas futuras también deben incluir la caracterización de pruebas en una variedad más amplia de fuentes de agua, en particular muestras ácidas, alcalinas o ricas en minerales que pueden inhibir los procesos biológicos necesarios para la activación del sensor.

En resumen, la capacidad de una prueba de biosensor para identificar correctamente el agua contaminada con fluoruro ≥1.5 ppm indica un enorme potencial para un nuevo enfoque para el diagnóstico de la calidad del agua, uno que requiere mucho menos equipo, experiencia, infraestructura y costo para operar. De hecho, la caracterización reciente de los mecanismos biológicos para detectar otros contaminantes prioritarios, incluidos el plomo34, el cobre35, los nitritos36 y el arsénico37, sugiere la posibilidad de realizar pruebas análogas en el punto de uso38 para todos estos analitos. La precisión, la simplicidad, la rapidez, el costo relativamente bajo y la facilidad de uso en el campo de estas pruebas facilitarían una implementación amplia, democratizando así el conocimiento sobre la seguridad del agua para todos.

El plásmido de ADN que codifica el biosensor de fluoruro utilizado en este estudio se ensambló mediante el ensamblaje de Gibson (New England Biolabs, Cat#E2611S) y se purificó con un Qiagen QIAfilter Midiprep Kit (QIAGEN, Cat#12143). Su secuencia de codificación consiste en el ribointerruptor de fluoruro crcB de Bacillus cereus que regula la producción de la enzima catecol 2,3-dioxigenasa, todo expresado bajo el promotor de consenso constitutivo de E. coli sigma 70 J2311939. Una secuencia completa del plásmido utilizado está disponible en Addgene con número de acceso 128810 (pJBL7025) [https://www.addgene.org/128810/].

Las reacciones de biodetección sin células utilizadas en las pruebas se configuraron de acuerdo con protocolos previamente establecidos20,40. Brevemente, las reacciones consisten en extracto celular aclarado, una mezcla de reactivos que contiene aminoácidos, sales amortiguadoras, agentes de acumulación, sustrato enzimático y una fuente de energía, y una mezcla específica de reacción de ADN molde y fluoruro de sodio en una proporción de aproximadamente 30/30/40. proporción (Tabla complementaria 3). Las reacciones de prueba no contenían fluoruro de sodio, mientras que las reacciones de control positivo se complementaron con fluoruro de sodio 1 mM para inducir la expresión génica. La concentración de plantilla de ADN para ambos conjuntos de reacciones fue de 5 nM, determinada por la concentración máxima de plantilla a la que no se observó cambio de color en ausencia de fluoruro.

Durante la configuración de la reacción, se prepararon mezclas maestras de extracto celular, mezcla de reactivos y mezcla de plantilla para las reacciones de prueba y de control positivo en tubos de microcentrífuga de 1,7 ml. A continuación, las reacciones individuales se dividieron en alícuotas en volúmenes de 20 µl en tiras de tubos de PCR para la liofilización. Después de alicuotar en hielo, las tapas de los tubos de PCR se perforaron con un alfiler, las tiras se envolvieron en papel de aluminio y luego las tiras envueltas se sumergieron en nitrógeno líquido para liofilizarlas durante aproximadamente 3 min. Las reacciones se transfirieron inmediatamente a un liofilizador de sobremesa Labconco FreeZone de 2,5 litros a -84 °C (n.º de catálogo 710201000) con una temperatura del condensador de -84 °C y una presión de 0,04 mbar y se liofilizaron durante la noche (≥16 h).

Después de la liofilización, las pruebas se sellaron al vacío (Máquina selladora al vacío KOIOS, Amazon, Número de identificación estándar de Amazon (ASIN) B07FM3J6JF) en una bolsa para guardar alimentos (Bolsa selladora al vacío KOIS, Amazon, ASIN B075KKWFYN), junto con un desecante (Dri- desecantes de tarjeta, Uline, n.° de catálogo S-19582) (Fig. 3 complementaria). Las reacciones selladas al vacío se marcaron luego en una bolsa exterior protectora de la luz (bolsas para alimentos Mylar con extremos abiertos, Uline, n.° de catálogo S-11661) y se sellaron con calor por impulso (sellador de bolsas de impulso de 8 pulgadas Metronic, Amazon, ASIN B06XC76JVZ) antes del envío. . Las pruebas también se enviaron con micropipetas de 20 µL de un solo uso (MICROSAFE® 20 µL, Safe-Tec LLC, Cat# 1020) para operación de campo.

Se utilizó un primer envío de pruebas de biosensores para evaluar 33 muestras de agua de los primeros 16 hogares encuestados. Todas estas pruebas dieron como resultado un color amarillo tenue, independientemente de la fuente de agua o la concentración de fluoruro establecida a través del fluorímetro. Esto probablemente fue causado por la degradación térmica de las pruebas durante el envío con la agencia de envío comercial. Si bien estudios anteriores informan la estabilidad en almacenamiento hasta por un año20,41, estas cifras se derivaron del almacenamiento en condiciones de laboratorio con temperatura controlada. Las rutas de envío comercial desde Illinois, EE. UU. a Nairobi, Kenia pasan por regiones extremadamente calurosas, por ejemplo, Dubái para este envío en particular. Estas condiciones eran muy diferentes de las del estudio de usabilidad del estudio anterior en Costa Rica, en el que las pruebas se transportaron por vía aérea comercial, con condiciones de envío y almacenamiento más cuidadosas20. Una investigación de laboratorio de la estabilidad de la temperatura de prueba indicó que las temperaturas de almacenamiento elevadas pueden causar que los componentes de la prueba se degraden, lo que da como resultado un color amarillo tenue al rehidratarse de acuerdo con las observaciones de campo (Fig. 2 complementaria).

Por lo tanto, el siguiente lote de pruebas se envió refrigerado el 25 de enero de 2022, lo que supusimos que extendería la estabilidad de almacenamiento de las pruebas para alinearse con los hallazgos anteriores. Una vez realizadas y empaquetadas las pruebas, se colocaron en un recipiente revestido con espuma de poliestireno antes de cubrirlas con un sistema de refrigeración NanoCool (Peli BioThermal). A continuación, el contenedor se cerró herméticamente y se envió usando un servicio de envío comercial estándar. Este lote de pruebas se mantuvo en la aduana, refrigerado, hasta su liberación el 28 de febrero de 2022. Estas pruebas se utilizaron en el campo desde el 5 de marzo hasta el 14 de marzo de 2022 para generar los datos sobre la precisión de las pruebas que se informan en este manuscrito.

Como la decoloración debida a la degradación térmica podría confundir el tono amarillo previsto en presencia de fluoruro (es decir, falsos positivos), evaluamos la precisión de la prueba usando solo pruebas que se habían refrigerado durante el envío y el transporte a las casas de los participantes. Por lo tanto, las 33 muestras de agua de los primeros 16 hogares se excluyeron del análisis de precisión de la prueba.

Los participantes fueron reclutados de seis sububicaciones (Kelelwet, Kipsimbol, Kigonor, Parkview, Lalwet y Mwariki) en Barut Ward dentro del condado de Nakuru (Figura complementaria 4, información geográfica adaptada de OpenStreetMap42). Esta ubicación fue elegida debido a los altos niveles de fluoruro y la familiaridad con las comunidades por parte del equipo de estudio.

Antes de recopilar datos, se realizaron reuniones comunitarias en cada sububicación para discutir las metas y objetivos del estudio. Después de obtener el permiso de los subjefes de la comunidad y de la aldea para realizar la investigación, se contrató a los movilizadores de la comunidad local para ayudar a identificar los hogares elegibles para participar. Individuos que tenían 18 años o más, habían vivido en el país de Nakuru durante más de tres meses, dependían de las fuentes de agua locales para beber, tenían un niño en el hogar, estaban dispuestos a discutir la situación del agua en su hogar y proporcionar una muestra de cada fuente. de agua en el hogar para la prueba de fluoruro fueron elegibles. Intentamos reclutar de 10 a 12 participantes de cada una de las cinco sububicaciones para garantizar una variedad de características sociodemográficas y fuentes de agua potable. Tener un niño residente fue un criterio para dilucidar los entendimientos de la comunidad sobre la fluorosis en los niños.

Después de obtener el consentimiento informado por escrito, los participantes participaron en una encuesta de 30 minutos (consulte la Fig. 1 complementaria para obtener una descripción gráfica de la recopilación de datos). Los temas incluyeron información sociodemográfica del hogar, conocimiento, actitudes y comportamientos sobre el fluoruro y la fluorosis, y la inseguridad del agua en el hogar utilizando la escala validada de Experiencias de Inseguridad del Agua en el Hogar (HWISE)43. Los 12 ítems HWISE consultan la frecuencia de experiencias con inseguridad hídrica en el mes anterior; "nunca" tiene una puntuación de 0, "a menudo/siempre" tiene una puntuación de 3, para un rango de 0 a 36. Estos datos se recopilaron para poder investigar si las experiencias o actitudes de los usuarios acerca de las pruebas variaban según las experiencias con la fluorosis o la inseguridad del agua. También se preguntó a los participantes sobre la cantidad de fuentes de su agua y su disposición a proporcionar y analizar muestras de agua. Las respuestas de la encuesta se registraron en tabletas utilizando Open Data Kit (ODK)44.

Después de completar la encuesta, los participantes proporcionaron de 1 a 3 muestras de agua de diferentes fuentes domésticas. Luego recibieron una breve explicación (~5 min) del proceso de prueba y luego analizaron sus propias muestras domésticas utilizando las pruebas del biosensor de fluoruro. Cada prueba constaba de un microtubo que era un control positivo y un segundo microtubo en el que se analizaba la muestra de interés. Para probar sus muestras, los participantes primero sacaron las pruebas de la bolsa de aluminio protectora contra la luz y de la bolsa sellada al vacío que contenía desecante, las cuales luego se desecharon (Fig. 3 complementaria). Luego se llenó una micropipeta con 20 µL de agua sumergiéndola lentamente hasta la línea de llenado. Para dispensar el agua, se usaron los dedos pulgar e índice para tapar los orificios de la micropipeta mientras que con la otra mano se apretaba el bulbo. A continuación, las reacciones se incubaron a temperatura ambiente durante un máximo de seis horas, más breve si hubo un cambio de color visible. Durante este tiempo de incubación, se pidió a los participantes que comprobaran cada hora el cambio de color amarillo y anotaran el tiempo que tardaba en producirse. Se esperaba que las pruebas se volvieran amarillas si los niveles de fluoruro eran ≥1,5 ppm, sin cambio de color para las pruebas de agua por debajo de este nivel. Se esperaba que todos los controles positivos se volvieran amarillos. Se leyó el cambio de color después de colocar las reacciones sobre un fondo blanco para el contraste visual.

El equipo de estudio volvió a realizar una segunda encuesta sobre las experiencias de los usuarios con el proceso de prueba y analizó las muestras de agua utilizando el fotómetro estándar de oro dentro de las 6 h. Se preguntó a los participantes sobre sus experiencias con el procedimiento de prueba, así como su interpretación del color de los resultados de las pruebas de muestra y control. También se tomaron fotografías de las reacciones completadas en este momento. Finalmente, el equipo de campo tomó medidas cuantitativas de fluoruro con un kit de fotómetro de rango alto de fluoruro de Hanna Instruments (n.º de cat. HI97739C), un método estándar de oro utilizado para evaluar la precisión de las pruebas de bioingeniería. Los resultados de la fotometría sobre las concentraciones reales de fluoruro medidas en muestras de agua se compartieron y explicaron a los participantes. Al finalizar la segunda encuesta, cada participante recibió KES 500 (USD 4,30) como remuneración por el tiempo y el esfuerzo dedicados a participar en la investigación. Cada hogar participante también recibió un filtro de agua potable de cerámica.

Los datos se recopilaron del 16 al 23 de noviembre de 2021 y del 5 de marzo al 14 de marzo de 2022. Durante las encuestas y las pruebas de agua, los participantes y los asistentes de investigación mantuvieron los protocolos de COVID-19 según las pautas del área local. El personal del estudio fue vacunado, mantuvo un distanciamiento social adecuado, se desinfectó las manos y limpió las herramientas de campo después de cada visita al hogar.

Los datos se exportaron de ODK a Microsoft Excel para su análisis. Se realizaron estadísticas descriptivas básicas para describir la sociodemografía de los participantes y las experiencias con la usabilidad, incluso si la interpretación del cambio de color de los participantes coincidía con la del personal del estudio. Dos autores agruparon temáticamente y codificaron de forma independiente los elementos abiertos sobre el conocimiento, las actitudes y el comportamiento relacionados con el fluoruro y la fluorosis. Las respuestas relacionadas con el conocimiento se caracterizaron como "correctas" si eran compatibles con la comprensión biomédica convencional, "incorrectas" o desconocidas.

El equipo de campo con sede en Kenia clasificó las pruebas como 'ENCENDIDAS' si eran visiblemente amarillas después de seis horas, y 'APAGADAS' si no había un cambio de color observable a simple vista. Estas evaluaciones fueron validadas de forma independiente por el equipo con sede en EE. UU. a partir de fotografías de las pruebas completadas. Las pruebas clasificadas como 'ON' se marcaron como verdadero positivo si correspondían a una concentración de fluoruro medida por un fotómetro ≥1,5 ppm, y falso positivo si correspondían a una concentración de fluoruro medida por un fotómetro <1,5 ppm. Las pruebas clasificadas como 'OFF' se marcaron como verdadero negativo si correspondían a un fotómetro que midió concentraciones de fluoruro <1,5 ppm, y falso positivo si correspondieron a un fotómetro que midió concentraciones de fluoruro ≥1,5 ppm. La sensibilidad se determinó mediante la relación entre los resultados positivos verdaderos y las mediciones positivas totales (positivos verdaderos y falsos combinados), mientras que la especificidad se determinó mediante la relación entre los resultados negativos verdaderos y las mediciones negativas totales (negativos verdaderos y falsos combinados), y calculado en Stata45. Los intervalos de confianza para la sensibilidad y la especificidad se calcularon utilizando el módulo diagt en Stata utilizando recuentos de verdaderos positivos, verdaderos negativos, falsos positivos y falsos negativos.

Nuestro tamaño de muestra objetivo para establecer la precisión de la prueba (objetivo 1) fue de 65, según la sensibilidad observada de 0,93 y la prevalencia observada de 0,7846. Aunque obtuvimos 90 muestras de agua, solo 57 eran adecuadas para este análisis (consulte "Envío del kit de prueba al condado de Nakuru, Kenia"); todavía se generaron estimaciones robustas con este tamaño de muestra. Para las pruebas de usabilidad (Objetivo 2), los datos sobre las experiencias con la rehidratación y la interpretación de 36 personas están muy por encima del número recomendado para los estudios de usabilidad47,48.

Obtuvimos la aprobación ética para este estudio de las juntas de revisión institucional de la Universidad de Northwestern (IRB STU00215306) y de Amref Health (AMREF-ESRC P1003/2021). También recibimos la autorización del Ministerio de Planificación y Desarrollo del condado de Nakuru, que es responsable de coordinar las actividades de investigación en el condado y los ministerios pertinentes. Todos los participantes dieron su consentimiento por escrito para participar en las actividades del estudio, incluido el consentimiento para tomar fotografías de las pruebas en el hogar. Los autores afirman que los participantes humanos de la investigación dieron su consentimiento informado para la publicación de las imágenes en la Fig. 3.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen de informes de investigación de Nature vinculado a este artículo.

Todos los datos de origen para las cifras principales y del SI se depositaron en acceso abierto en la base de datos Arch de Northwestern (https://arch.library.northwestern.edu). Se puede acceder a los datos a través de https://doi.org/10.21985/n2-zyy5-cp15. Una secuencia completa del plásmido utilizado está disponible en Addgene con número de acceso 128810 (pJBL7025) [https://www.addgene.org/128810/].

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Descargar referencias

En primer lugar, agradecemos sinceramente a todos los participantes del estudio por darnos la bienvenida a sus hogares y compartir sus experiencias con la inseguridad del agua y las pruebas de agua. Por su asistencia en la recopilación de datos, agradecemos a Janet Barsolai Chepchirchir y Maxwell Otieno Aduogo, junto con James Yegon (SOAR-Kenya Academy) por su asistencia en la movilización comunitaria. También nos gustaría agradecer a Charlotte Knopp (Universidad de Northwestern) por administrar el envío de reacción de los Estados Unidos a Kenia. Agradecemos a Dylan Brown (Northwestern University) por sus valiosos conocimientos sobre la estabilidad de la temperatura del sensor y por proporcionar algunos de los reactivos utilizados en este estudio, junto con Hilary Bethancourt (Northwestern University) por sus consejos sobre análisis estadístico. Este trabajo fue apoyado por Carnegie Corporation; el Instituto de Investigación de Políticas de la Universidad Northwestern y el Centro de la Familia Crown para Estudios Judíos e Israelíes; el apoyo del pueblo estadounidense brindado al Laboratorio de Innovación de Intensificación Sostenible Feed the Future a través del Acuerdo de Cooperación de la Agencia de los Estados Unidos para el Desarrollo Internacional AID-OAA-L-14-00006; y el Comando de Contratación del Ejército de los Estados Unidos W52P1J-21-9-3023.

Estos autores contribuyeron igualmente: Walter Thavarajah, Patrick Mbullo Owuor.

Departamento de Ingeniería Química y Biológica, Universidad Northwestern, 2145 Sheridan Road, Evanston, IL, 60208, EE. UU.

Walter Thavarajah y Julius B. Lucks

Centro de Biología Sintética, Universidad Northwestern, 2145 Sheridan Road, Evanston, IL, 60208, EE. UU.

Walter Thavarajah, Julius B. Lucks y Sarah L. Young

Centro de Investigación del Agua, Universidad Northwestern, 2145 Sheridan Road, Evanston, IL, 60208, EE. UU.

Walter Thavarajah, Julius B. Lucks y Sarah L. Young

Centro de Ingeniería, Sostenibilidad y Resiliencia, Universidad Northwestern, 2145 Sheridan Road, Evanston, IL, 60208, EE. UU.

Walter Thavarajah, Julius B. Lucks y Sarah L. Young

Departamento de Antropología, Universidad Northwestern, 1810 Hinman Avenue, Evanston, IL, 60208, EE. UU.

Patrick Mbullo Owuor, Rahul Aggarwal y Sarah L. Young

Instituto de Investigación de Políticas, Universidad Northwestern, 2040 Sheridan Road, Evanston, IL, 60208, EE. UU.

Patrick Mbullo Owuor

Programa de Estudios Africanos, Universidad Northwestern, 620 Library Pl, Evanston, IL, 60208, EE. UU.

Patrick M. Young y Sarah L. Young

Departamento de Ciencias de la Gestión y Planificación de Proyectos, Universidad de Nairobi, PO Box 30197, GPO, Nairobi, Kenia

Diana Ross Awuor

Departamento de Epidemiología y Estadísticas Médicas, Escuela de Salud Pública, Universidad Moi, PO Box 4606-30100, Eldoret, Kenia

Karlmax Kiprotich

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Conceptualización, WT, PMO, JBL y SLY; Curación de datos, PMO, DA, KK y RA; Análisis formal, WT y RA; Investigación, PMO, DA y KK; Metodología, WT, PMO, DA, KK, JBL, SLY; Administración de proyectos, WT, PMO, JBL y SLY; Adquisición de fondos JBL & SLY; Redacción: borrador original, WT, PMO, RA, JBL, SLY; Redacción: revisión y edición, WT, PMO, DA, KK, RA, JBL y SLY

Correspondencia a Julius B. Lucks o Sera L. Young.

Los autores declaran los siguientes intereses financieros en competencia: WT y JBL tienen una patente (Número de publicación internacional WO 2020/185451 A3) para los desarrollos tecnológicamente importantes incluidos en este trabajo. JBL es cofundador de Stemloop, Inc. Los intereses de JBL son revisados ​​y administrados por Northwestern University de acuerdo con sus políticas de conflicto de intereses.

Reconocemos las posibles desigualdades en la colaboración entre investigadores de países de ingresos altos y países de ingresos bajos o medianos, y estuvimos atentos a la inclusión durante el diseño, la implementación, el análisis y la difusión de los hallazgos del estudio. Seguimos todas las reglas nacionales y locales en Kenia relacionadas con la investigación con sujetos humanos, así como las de la institución estadounidense. Tanto los científicos estadounidenses como los de Kenia se incluyeron en el diseño del estudio, la creación de instrumentos de recopilación de datos, la interpretación de los datos y como coautores de este documento.

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Reimpresiones y permisos

Thavarajah, W., Owuor, PM, Awuor, DR et al. La precisión y usabilidad de los biosensores de fluoruro en el punto de uso en las zonas rurales de Kenia. npj Agua Limpia 6, 5 (2023). https://doi.org/10.1038/s41545-023-00221-5

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Recibido: 08 julio 2022

Aceptado: 23 de enero de 2023

Publicado: 08 febrero 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41545-023-00221-5

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