Sensación de sabor alcalino a través del canal de cloruro alcalinofilo en Drosophila

Jun 18, 2023

Nature Metabolism volumen 5, páginas 466–480 (2023)Citar este artículo

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El sentido del gusto es un centinela importante que rige lo que debe o no debe ingerir un animal, y la sensación de pH alto juega un papel fundamental en la selección de alimentos. Aquí exploramos las identidades moleculares de los receptores del gusto que detectan el pH básico de los alimentos usando Drosophila melanogaster como modelo. Identificamos un canal de cloruro llamado alkaliphile (Alka), que es necesario y suficiente para las respuestas gustativas aversivas a los alimentos básicos. Alka forma un canal de cloruro controlado por pH alto y se expresa específicamente en un subconjunto de neuronas receptoras gustativas (GRN). La activación optogenética de GRN que expresan alka es suficiente para suprimir las respuestas de alimentación atractivas a la sacarosa. Por el contrario, la inactivación de estos GRN provoca graves alteraciones en la aversión al pH alto. En conjunto, nuestro descubrimiento de Alka como un receptor de sabor alcalino sienta las bases para futuras investigaciones sobre la sensación de sabor alcalino en otros animales.

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Descargar referencias

Agradecemos a S. Chan y P. Nguyen por sus contribuciones técnicas a este estudio. También agradecemos al Bloomington Drosophila Research Center por las poblaciones de moscas y al Drosophila Genome Research Center por los clones de ADN. Agradecemos a los laboratorios de DR Reed, M. Hakan Ozdener e I. Matsumoto en Monell Chemical Senses Center por compartir equipos e instalaciones. Nuestro trabajo fue apoyado por las subvenciones R01 DC018592 (YVZ) y R01 DC007864 (CM) del Instituto Nacional sobre Sordera y otros Trastornos de la Comunicación, la Fundación Ambrose Monell (YVZ) y el Programa Nacional de Investigación y Desarrollo Clave del Proyecto de China 2018YFA0108001 (Z.- QT).

Estos autores contribuyeron igualmente: Tingwei Mi, John O. Mack.

Monell Chemical Senses Center, Filadelfia, Pensilvania, EE. UU.

Tingwei Mi, John O. Mack, Wyatt Koolmees, Quinn Lyon, Luke Yochimowitz, Peihua Jiang y Yali V. Zhang

Laboratorio Estatal Clave de Células Madre y Biología Reproductiva, Instituto de Zoología, Academia China de Ciencias, Instituto de Beijing para Células Madre y Medicina Regenerativa, Beijing, China

Zhao-Qian Teng

Departamento de Biología Molecular, Celular y del Desarrollo, Universidad de California, Santa Bárbara, CA, EE. UU.

craig montell

Departamento de Fisiología, Centro de Investigación de la Diabetes, Facultad de Medicina Perelman de la Universidad de Pensilvania, Filadelfia, Pensilvania, EE. UU.

Yali V Zhang

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YVZ concibió este trabajo. TM, JOM, WK, QL y LY llevaron a cabo los experimentos de alimentación y genética molecular. TM y Z.-QT realizaron análisis patch-clamp. WK, PJ, LY y YVZ realizaron ensayos de inmunohistoquímica y registro de puntas. TM, JOM, WK, CM y YVZ interpretaron los datos y redactaron el artículo. YVZ supervisó el proyecto.

Correspondencia a Yali V. Zhang.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Nature Metabolism agradece a los revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo. Editor principal de manejo: Ashley Castellanos-Jankiewicz, en colaboración con el equipo de Nature Metabolism.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a los reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

a, Probamos una amplia gama de receptores y canales iónicos candidatos, una muestra representativa de los cuales se muestra en el gráfico de barras. Estos incluyen la familia de receptores gustativos (Gr), como Gr66a y Gr33a; la familia de receptores ionotrópicos de glutamato (Ir), como Ir76b e Ir25a; la familia de canales iónicos de potencial receptor transitorio (trp), como trpl y trpA1; la familia de las otopetrinas, como otopla; el tipo de canal transmembrana (tmc); y genes con funciones desconocidas, como CG12344. n = 10 ensayos. b, Respuestas de alimentación a alimentos neutros versus alcalinos entre moscas de control y moscas mutantes de la familia LGCC de moscas. n = 10 ensayos. Media ± sem, ANOVA unidireccional con pruebas posthoc de Tukey, ****p < 0,0001.

Datos fuente

a, Composición genómica de los genes alka mutantes y de tipo salvaje, incluidos los codones, exones e intrones de inicio de la traducción (ATG) y terminación (*). Las flechas rojas indican los sitios de destino del ARN guía (ARNg) (ARNg1 y ARNg2). Para detectar el mutante alka1, diseñamos tres conjuntos de cebadores, P1, P2 y P3, que flanqueaban los sitios de orientación de gRNA. b, análisis de PCR de ADN genómico con los cebadores P1, P2 y P3 para moscas mutantes de tipo salvaje (wt) y alka1. c, La topología predicha de la proteína Alka que comprende cuatro segmentos transmembrana. Se prevé que el dominio TM2 (rojo) recubra el poro del canal. Los extremos N- y C-terminal de la proteína Alka residen en el lado extracelular. Las flechas rojas muestran las regiones de proteína ablacionadas en el mutante alka1.

a, Análisis estadísticos de las frecuencias de picos producidos por sensilla tipo L, I y S que responden a NaOH 10 mM en moscas de tipo salvaje (wt). n = 11 moscas. Media ± sem, ANOVA unidireccional con pruebas posthoc de Tukey, ****p < 0,0001. b, Picos representativos evocados por NaCl 10 mM (pH 7) en S6 sensilla para moscas mutantes wt y alka1. La flecha indica el inicio del estímulo. c, Análisis estadísticos de las frecuencias de picos producidos por S6 sensilla en respuesta a diferentes concentraciones de NaCl para moscas mutantes wt y alka1. n = 10 moscas. Media ± sem, pruebas t de Student de dos colas no apareadas.

Datos fuente

a–b, Expresión de alka-gal4;UAS-mCD8::GFP en el segmento tarsal de la pata delantera de la mosca. c, PER a soluciones alcalinas que contienen sacarosa 30 mM y varias concentraciones de NaOH entre moscas de tipo salvaje (wt), alka1, alka1;Ir761 y de rescate. n = 12 ensayos. Media ± sem, ANOVA de dos vías con pruebas posthoc de Tukey, **p = 0,0081, ****p < 0,0001. d, Expresión de alka-gal4;UAS-mCD8::GFP en el palpo maxilar. e, Expresión de alka-gal4;UAS-mCD8::GFP en la antena. f, No se detectaron señales anti-Alka obvias en el cerebro adulto wt. g, Patrón de localización relativa entre los GRN que expresan ppk28 y la sensibilidad gustativa. Barras de escala: 10 μm (a–b, d–e, g), 50 μm (f).

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Las identidades de secuencias de proteínas entre Alka y GlyRa1 en otras especies son las siguientes: pez cebra, 30% de identidad; ratón, 30% de identidad; humano, 30% identidad. Los residuos de aminoácidos idénticos están etiquetados en rojo, mientras que los residuos de aminoácidos similares entre al menos tres especies están etiquetados en amarillo y resaltados en negrita. Las cuatro regiones transmembrana (TM1-TM4) se indican mediante barras negras sobre sus secuencias de aminoácidos.

a, Localización de Alka en células HEK293 que expresan Alka que está fusionada en el extremo N con una etiqueta Myc. Barra de escala: 5 μm. b, Configuración de la configuración de grabación de abrazadera de parche de celda completa. Usamos una pipeta estimulante (roja) para aplicar localmente soluciones de alto pH a las células y una pipeta de parche (azul) para realizar registros de células completas. c, Relaciones de corriente-voltaje (IV) de células HEK293 expresadas con Alka, que se provocaron mediante rampas de voltaje de -80 mV a +80 mV. La solución del baño contenía NaF, NaCl, NaBr o NaI 150 mM y la solución intracelular contenía CsCl 150 mM. d, análisis estadísticos de potenciales de inversión de experimentos en c. n = 11 células (NaF, NaBr o NaI); n = 14 células (NaCl). Media ± sem, ANOVA unidireccional con pruebas posthoc de Tukey, **p = 0,0012, ****p < 0,0001. e, permeabilidad aniónica relativa de Alka. n = 11 células (NaF, NaBr o NaI); n = 14 células (NaCl). Media ± sem, ANOVA unidireccional con pruebas posthoc de Tukey, ***p = 0,0003. f, g, Corrientes de células que expresan Alka y células de control sin expresión de Alka que responden a los estímulos de soluciones isosmóticas ácidas. n = 11 celdas. Media ± sem, pruebas t de Student de dos colas no apareadas. h–k, Corrientes evocadas por células que expresan Alka y células de control sin expresión de Alka en respuesta a los estímulos de glicina (0.001–1 mM) (h,i) o GABA (0.001–1 mM) (j,k). n = 11 celdas. Media ± sem, pruebas t de Student de dos colas no apareadas. Las células se sujetaron a -70 mV. Las flechas indican el inicio del estímulo.

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a, Picos evocados por sensilla L7 que responden a estímulos de pH alto en moscas alka1;Gr64f-Gal4 o alka1;UAS-alka. b, análisis estadísticos de las frecuencias de los picos para moscas alka1;UAS-alka y alka1;Gr64f-Gal4. n = 11 moscas. Media ± sem, pruebas t de Student de dos colas no apareadas. c, Picos producidos por sensilla L7 que responden a sacarosa 50 mM en moscas alka1;Gr64f-Gal4/UAS-alka o alka1;Gr64f-Gal4/UAS-alkaP276A. d, análisis estadísticos de las frecuencias de los picos para las moscas alka1;Gr64f-Gal4/UAS-alka y alka1;Gr64f-Gal4/UAS-alkaP276A. n = 11 moscas. Media ± sem, pruebas t de Student de dos colas no apareadas. Las flechas indican el inicio del estímulo.

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a–b, Expresión de alka-Gal4,UAS-mCD8::GFP;Orco-Gal80 en la antena (a) y el palpo maxilar (b). c, Expresión de alka-Gal4,UAS-mCD8::GFP;Orco-Gal80 en el labelo. d, proyecciones GRN en el cerebro de la mosca alka-Gal4,UAS-mCD8::GFP;Orco-Gal80. SEZ, zona subesofágica; AL, lóbulo antenal. Barras de escala: 10 μm (a–c), 50 μm (d).

a–b, expresión de GFP en el labelo de Gr66a-Gal4,UAS-GFP;LexAop-Gal80 (a) o Gr66a-Gal4,UAS-GFP;Gr66a-lexA,LexAop-Gal80 (b). Barra de escala: 10 μm. c, Localización relativa entre los GRN que expresan alka y la sensibilidad gustativa de tipo S en el labelo de mosca alka-Gal4,UAS-GFP;Gr66a-lexA,LexAop-Gal80. Barra de escala: 10 μm. d, PER a alimentos dulces (sacarosa 50 mM), alimentos alcalinos (NaOH 10 mM mezclado con sacarosa 30 mM) y alimentos amargos (cafeína 10 mM mezclada con sacarosa 30 mM) para alka-TNT (alka-Gal4,UAS-TNT ), alka-TNT;Orco-Gal80 (alka-Gal4,UAS-TNT;Orco-Gal80), alka-TNT;Gr66a-Gal80(alka-Gal4,UAS-TNT;Gr66a-lexA,LexAop-Gal80), Gr66a- TNT(Gr66a-Gal4,UAS-TNT),Gr66a-TNT;Gr66a-Gal80 (Gr66a-Gal4,UAS-TNT;Gr66a-lexA,LexAop-Gal80), ppk23-TNT (ppk23-Gal4,UAS-TNT), ppk28 -TNT (ppk28-Gal4,UAS-TNT) y moscas de tipo salvaje (wt). n = 11 ensayos. Media ± sem, ANOVA unidireccional con pruebas posthoc de Tukey, ****p < 0,0001.

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Secciones complementarias 1 (anticuerpos), 2 (genética molecular) y 3 (títulos de videos de datos extendidos).

La mosca de control alka-Gal4 muestra sacarosa persistente (500 mM) alimentándose en presencia y ausencia de un estímulo de luz roja intensa (2000 lux).

La mosca alka-Gal4, UAS-CsChrimson; Orco-Gal80 exhibió una alimentación normal de sacarosa (500 mM) en ausencia de luz roja pero un cese de la alimentación en respuesta a un estímulo moderado de luz roja (1200 lux).

Fuente de datos estadísticos.

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Reimpresiones y permisos

Mi, T., Mack, JO, Koolmees, W. et al. Sensación de sabor alcalino a través del canal de cloruro alcalinofilo en Drosophila. Nat Metab 5, 466–480 (2023). https://doi.org/10.1038/s42255-023-00765-3

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Recibido: 15 Agosto 2022

Aceptado: 09 febrero 2023

Publicado: 20 de marzo de 2023

Fecha de emisión: marzo de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s42255-023-00765-3

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