El cloruro de zinc es eficaz como antibiótico en la prevención de biopelículas después de la septoplastia

Mar 23, 2023

Scientific Reports volumen 13, Número de artículo: 8344 (2023) Citar este artículo

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Las infecciones bacterianas en estado de biopelícula asociadas con dispositivos médicos insertados constituyen un problema financiero y de salud masivo en todo el mundo. Aunque las bacterias exhiben una susceptibilidad significativamente menor a los antibióticos en el estado de biopelícula, el enfoque de tratamiento más común todavía se basa en antibióticos, lo que exacerba el fenómeno de las bacterias resistentes a los antibióticos. En este estudio, nuestro objetivo fue evaluar si el recubrimiento de ZnCl2 de las férulas intranasales de silicona (ISS) puede reducir las infecciones de biopelícula asociadas con la inserción de estos dispositivos y prevenir el uso excesivo de antibióticos mientras se minimizan los desechos, la contaminación y los costos. Probamos la capacidad de ZnCl2 para prevenir la formación de biopelículas en la ISS tanto in vitro como in vivo mediante el ensayo de formación de biopelículas en placa de microtitulación, tinción con cristal violeta y microscopía electrónica y confocal. Encontramos una disminución significativa en la formación de biopelículas entre el grupo de tratamiento y el control de crecimiento cuando se colocaron férulas recubiertas de ZnCl2 en la flora nasal de los pacientes. De acuerdo con estos resultados, las infecciones asociadas con la inserción de ISS pueden prevenirse mediante el uso de un recubrimiento de ZnCl2, evitando así el uso excesivo y el abuso de antibióticos.

Las infecciones asociadas a dispositivos médicos son en gran medida responsables del aumento de la morbilidad y la mortalidad en los pacientes y de las graves pérdidas financieras de los servicios de atención médica1. Actualmente, una amplia gama de procesos médicos en casi todos los campos de la medicina requieren la inserción de cuerpos extraños en el cuerpo del paciente que pueden causar infecciones graves, denominadas infecciones relacionadas con cuerpos extraños (FBRI)2. La gran mayoría de estas infecciones son causadas por bacterias, particularmente en estado de biopelícula, que colonizan las superficies de dispositivos médicos extraños insertados. Las infecciones de los dispositivos médicos suelen ocurrir durante el procedimiento de implantación como resultado de la inoculación de un pequeño número de bacterias que se originan en la piel o la membrana mucosa del paciente. Sin embargo, la inoculación también puede provenir de las manos del personal quirúrgico, de desinfectantes contaminados y del ambiente del hospital2,3.

La cirugía septal (septoplastia), un procedimiento quirúrgico para corregir un tabique nasal desviado, es uno de los procedimientos quirúrgicos más comunes en la cirugía facial4,5,6,7. Los ISS se utilizan a menudo en la septoplastia para estabilizar el tabique operado y el cartílago restante, promover la cicatrización de la mucosa y prevenir la sinequia nasal8,9,10. Los microorganismos más comunes asociados con las infecciones relacionadas con las férulas nasales son Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella pneumonia y Enterobacter aerogenes11,12, principalmente en forma de biopelícula.

Una biopelícula es un agregado organizado de microorganismos incrustados dentro de una matriz de producción propia de sustancias poliméricas extracelulares (EPS) que se adhiere a una superficie biótica o abiótica y se forma en un proceso complejo y dinámico de unión reversible, unión irreversible, crecimiento y diferenciación, y difusión13. El estado de biopelícula agiliza el intercambio de plásmidos entre bacterias, algunas de las cuales a menudo contienen genes codificantes de resistencia a múltiples fármacos. Por lo tanto, las biopelículas también presentan el peligro de aumentar las bacterias resistentes a los antibióticos14,15.

El principio básico del control de infecciones asociadas a dispositivos se basa en la prevención más que en el tratamiento, en vista de la alta probabilidad de un rápido empeoramiento de la infección tras el desarrollo de biopelículas14,16. Actualmente, los antibióticos son el tratamiento más común para las infecciones asociadas a dispositivos médicos2,17. Sin embargo, debido a la reducida susceptibilidad de la bacteria a los antibióticos en estado de biopelícula18, el tratamiento de estas infecciones suele pasar por la retirada del dispositivo implantado y, si es posible o necesario, su sustitución por un nuevo dispositivo2,19. Actualmente, el principal curso de acción después de la cirugía nasal es la administración de antibióticos profilácticos sistémicos, aunque no está universalmente aceptado como efectivo11,20. Se sabe que más del 70% de las infecciones bacterianas son resistentes a uno o más de los antibióticos generalmente utilizados para la erradicación de infecciones21. Esto ha resultado en una búsqueda masiva de sustancias antimicrobianas alternativas y enfoques de tratamiento alternativos para prevenir infecciones bacterianas y bacterianas en estado de biopelícula2,16,22. Una estrategia importante para prevenir la formación de biopelículas relacionadas con los dispositivos médicos es la modificación de la superficie: la aplicación de agentes antibacterianos o antiadherentes sobre la superficie del dispositivo médico22,23. Dadas las desventajas de los antibióticos antes mencionadas, la tendencia actual es el desarrollo de recubrimientos no antibióticos para dispositivos médicos, como los recubrimientos a base de metal24,25.

Los metales se han utilizado como agentes antibacterianos durante décadas en la vida diaria, la industria, la agricultura y el cuidado de la salud. Ciertos metales son cruciales para la bioquímica de la vida en todos los organismos, cumpliendo funciones celulares que no pueden ser reemplazadas por moléculas orgánicas, por lo que son reconocidos como metales esenciales, de los cuales los elementos antibacterianos más comunes son el zinc, la plata y el cobre26,27,28, 29 Sin embargo, cuando se presenta en altas concentraciones, el zinc también es tóxico para las células bacterianas debido al bloqueo de reacciones esenciales en ellas30,31. Se sabe que el zinc tiene una amplia gama de actividades antibacterianas y antibiopelículas, que afectan a muchas cepas bacterianas al interferir con varios procesos celulares e inhibir eficazmente su crecimiento30,31. Ya se ha demostrado que el cloruro de zinc (ZnCl2) tiene actividad antibacteriana y antibiopelícula32,33, aunque según nuestro conocimiento, no se ha utilizado para la prevención o el tratamiento de infecciones relacionadas con dispositivos médicos.

Presumimos que el uso del recubrimiento de ZnCl2 para dispositivos médicos reducirá las infecciones bacterianas asociadas con la inserción de estos dispositivos y evitará el uso innecesario de antibióticos al tiempo que minimizará los desechos, la contaminación y los costos. Este estudio se centró en las férulas nasales como una aplicación modelo de dispositivo médico del recubrimiento de ZnCl2 y, por lo tanto, nuestros objetivos fueron los siguientes: (1) investigar la actividad antibacteriana y antibiopelícula de ZnCl2 contra bacterias clínicamente aisladas in vitro; (2) investigar la actividad antibacteriana y antibiopelícula de las férulas recubiertas de ZnCl2 in vitro; (3) examinar el efecto de la presencia prolongada de ZnCl2, descartando una posible toxicidad local o sistémica in vivo; y (4) evaluar la eficacia de las férulas recubiertas de ZnCl2 in vivo (estudios preliminares).

Se encontró que las cepas de Staphylococcus aureus eran susceptibles a ZnCl2 tanto para las células planctónicas como para las de biopelícula y mostraron una disminución significativa en la viabilidad cuando se presentaron con concentraciones de ZnCl2 que oscilaban entre 0,9 y 7,0 mM (Tabla 1). Para las células planctónicas, el valor de concentración inhibitoria mínima (MIC) se obtuvo a una concentración de ZnCl2 de 1,2 mM para ambas cepas, y los valores de concentración bactericida mínima (MBC) oscilaron entre 5,0 y 7,0 mM. Para las células de biopelícula, los valores de concentración preventiva de biopelícula (BPC) oscilaron entre 0,9 y 1,0 mM. Se encontró que las cepas de E. aerogenes eran susceptibles a ZnCl2 tanto para el biofilm como para las células planctónicas. Se obtuvo BPC a 2,0 mM para ambas cepas, los valores de MIC variaron de 3,0 a 4,0 mM y MBC no se encontró dentro del rango probado. Para las cepas de P. aeruginosa, se obtuvo BPC a 4,0 mM para ambas cepas. Sin embargo, no se encontraron valores de MIC o MBC para las células planctónicas dentro del rango probado.

La formación de biopelículas en las férulas recubiertas con ZnCl2 de tres cepas bacterianas clínicas diferentes, P. aeruginosa, E. aerogenes y S. aureus, se inhibió significativamente (p < 0,001) en un 55–70 % en comparación con el control de crecimiento positivo de bacterias no bacterianas. Férulas recubiertas de ZnCl2 (datos no mostrados). La inhibición se logró con éxito y fue consistente a lo largo de 168 h de incubación, sin diferencias significativas.

CLSM se utilizó para evaluar la formación de biopelículas de tres cepas bacterianas clínicas diferentes, S. aureus, P. aeruginosa y E. aerogenes, en férulas recubiertas de ZnCl2 y en férulas no recubiertas de ZnCl2 como control positivo del crecimiento. El crecimiento de biopelículas en las superficies de las férulas se evaluó mediante dos métodos: primero, por el área cubierta por bacterias (%), cuantificando la capacidad de las bacterias para adherirse a la superficie de las férulas, y segundo, por la intensidad media de la señal, cuantificando la cantidad de masa de biopelículas. . Del área medida cubierta por bacterias (%) (Fig. 1, columna derecha), tanto en S. aureus como en E. aerogenes, no se encontraron diferencias significativas en la capacidad de adherirse a las superficies de las férulas entre las férulas recubiertas de ZnCl2 y las no -Férulas recubiertas de ZnCl2. Se exhibió una disminución significativa (p < 0,01) en esta capacidad en P. aeruginosa. Todas las cepas exhibieron una disminución significativa (S. aureus y P. aeruginosa: p < 0,01, E. aerogenes: p < 0,05) en la masa media de biopelícula en las férulas recubiertas de ZnCl2 en comparación con las férulas recubiertas solo con polímero (Fig. 1, columna izquierda y Fig. 2).

Área cubierta por biopelícula bacteriana (%) e intensidad de señal media de biopelícula in vitro, evaluada por CLSM. Se cultivaron biopelículas de Staphylococcus aureus (a,b), Pseudomonas aeruginosa (c,d) y Enterobacter aerogenes (e,f) en férulas recubiertas de ZnCl2 y en férulas no recubiertas de ZnCl2 sin ZnCl2 como controles de crecimiento positivos. Piezas de estas férulas se tiñeron con yoduro de propidio (PI) y CLSM evaluó el área de cada pieza cubierta por biopelícula bacteriana (columna derecha) y la intensidad media de la señal, cuantificando la cantidad de biopelícula formada en la superficie de la férula (columna izquierda). ). Los valores P se proporcionan mediante la prueba t no pareada (*p 0,05; **p < 0,01; ***p < 0,001).

Producción confocal de biopelícula bacteriana in vitro, evaluada por CLSM. Se cultivaron biopelículas de Enterobacter aerogenes (a,d), Pseudomonas aeruginosa (b,e) y Staphylococcus aureus (c,f) en férulas recubiertas de ZnCl2 y en férulas no recubiertas de ZnCl2 como controles de crecimiento positivos. Piezas de estas férulas se tiñeron con yoduro de propidio (PI) y se evaluaron mediante CLSM.

Después de retirar las férulas recubiertas de ZnCl2 de las cavidades nasales de tres pacientes, las piezas de la férula se evaluaron mediante CLSM para el área cubierta por bacterias (%), cuantificando la capacidad de adherirse a la superficie de la férula y la intensidad de señal media, cuantificando la cantidad de masa de biopelícula. Para el control de crecimiento negativo, utilizamos férulas no recubiertas de ZnCl2 que se usan regularmente en las cavidades nasales de dos pacientes que recibieron profilaxis antibiótica durante 7 días antes de retirar las férulas y que CLSM evaluó utilizando los mismos criterios. Todos los pacientes tratados exhibieron una disminución significativa (p < 0,05) de más del 67 % en la intensidad de señal media en las férulas recubiertas de ZnCl2 en comparación con el paciente de control 1 (Figs. 3a y 4). Sin embargo, no se encontraron diferencias significativas entre los pacientes del tratamiento y el paciente control 2. En el área cubierta por bacterias (%), no encontramos diferencias significativas entre los tres grupos de tratamiento (Fig. 3b). Se encontraron disminuciones significativas (p < 0,05) al comparar el área cubierta por bacterias (%) entre el paciente de control 1 y los pacientes de tratamiento 2 y 3 y entre el paciente de control 2 y el paciente de tratamiento 3.

Intensidad de señal media (a) y área cubierta por bacterias (%) (b) de crecimiento de biopelícula, in vivo, en férulas, después de la inserción, evaluado por CLSM. Piezas de férulas recubiertas con ZnCl2 de las narices de tres pacientes (los pacientes de tratamiento) y férulas no recubiertas con ZnCl2 de las narices de dos pacientes que recibieron antibióticos profilácticos (el control de crecimiento negativo) se tiñeron con PI para la evaluación CLSM. Se evaluó la intensidad de señal media de las piezas de la férula, cuantificando la cantidad de crecimiento bacteriano en la superficie de la férula (a) y el área cubierta por el crecimiento bacteriano (%) en cada pieza (b). Los resultados que no difieren significativamente entre sí según la prueba de diferencia honestamente significativa (HSD) de Tukey se agrupan bajo la misma letra (p < 0,05).

Producciones confocales de biopelícula bacteriana, in vivo, en férulas, post inserción, evaluadas por CLSM. Fragmentos de férulas recubiertas de ZnCl2 de la nariz de tres pacientes (los pacientes de tratamiento) (a–c) y férulas no recubiertas de ZnCl2 de la nariz de dos pacientes que recibieron antibióticos profilácticos (el control de crecimiento negativo) (d,e) fueron teñidos con PI y evaluados por CLSM.

Se evaluó la formación de biopelículas de tres cepas bacterianas clínicas diferentes mediante microscopía electrónica de barrido (SEM). S. aureus, E. aerogenes y P. aeruginosa se inhibieron cuando las bacterias se cultivaron en férulas recubiertas de ZnCl2 en comparación con el control de crecimiento positivo de férulas no recubiertas de ZnCl2 (Fig. 5). Todas las cepas bacterianas exhibieron cargas bacterianas bajas en las férulas recubiertas de ZnCl2 y cargas bacterianas altas en las férulas no recubiertas de ZnCl2.

Crecimiento de biopelículas de bacterias clínicas en férulas recubiertas de ZnCl2 y en férulas no recubiertas de ZnCl2, capturadas por SEM. Staphylococcus aureus (a–d), Enterobacter aerogenes (e–h) y Pseudomonas aeruginosa (i–l) se cultivaron durante 48 h en férulas recubiertas de ZnCl2 (b,d,f,h,j,l) y en crecimiento positivo control de férulas no recubiertas de ZnCl2 (a,c,e,g,i,k). Las imágenes se tomaron con un voltaje de aceleración de 2 kV con aumentos de 1000 (a,b,e,f,i,j) y 10,000 (c,d,g,h,k,l).

Todas las férulas recubiertas de ZnCl2, extraídas después de un período de 7 días en las cavidades nasales de tres pacientes en tratamiento, exhibieron una carga bacteriana baja (Fig. 6a-i), junto con las células sanguíneas que permanecieron adheridas a la superficie de la férula después de la cirugía (Fig. 6a). Las férulas sin recubrimiento de ZnCl2 del paciente de control 1 (Fig. 6j–l) exhibieron una carga bacteriana media, con dos tipos de colonias bacterianas: bacilos (Fig. 6k) y cocos (Fig. 6l). El paciente de control 2 (Fig. 6m–o) exhibió una carga bacteriana baja.

Férulas tomadas de los pacientes clínicos después de un período de 7 días en las cavidades nasales de los pacientes, capturadas por SEM. Se insertaron férulas recubiertas de ZnCl2 (a–i) en las cavidades nasales de tres pacientes durante un período de 7 días después de la septoplastia. Se insertaron férulas regulares no recubiertas de ZnCl2 (j-o) durante un período de 7 días en las cavidades nasales de dos pacientes bajo tratamiento antibiótico profiláctico y se usaron como controles de crecimiento negativos. Se retiraron las férulas de las cavidades nasales de los pacientes y se capturaron mediante SEM; paciente de tratamiento 1 (a–c), paciente de tratamiento 2 (d–f), paciente de tratamiento 3 (g–i), paciente de control 1 (j–l) y paciente de control 2 (m–o). Las imágenes se tomaron con un voltaje de aceleración de 2 kV con aumentos de 1000 (columna izquierda), 10 000 (columna central) y 20 000 (columna derecha).

No se observaron signos clínicos patológicos ni diferencias histológicas en la mucosa nasal entre los grupos de tratamiento con férula recubierta de ZnCl2 y sin férula recubierta de ZnCl2 (datos no mostrados).

El abuso y mal uso de los antibióticos en las últimas décadas ha llevado a un rápido y preocupante aumento en el rango de cepas bacterianas resistentes a los antibióticos, lo que ha generado una fuerte necesidad de buscar sustancias antibacterianas alternativas2,22,34. Aunque no se acepta universalmente que sea eficaz, la profilaxis antibiótica en la septoplastia es un procedimiento común para la prevención de infecciones relacionadas con el sitio quirúrgico11,20. En un estudio reciente11, se demostró que se produce un crecimiento bacteriano después de la inserción del ISS independientemente de la terapia antibiótica profiláctica, junto con un aumento de las bacterias resistentes a los antibióticos, lo que demuestra activamente la urgencia de reemplazar el uso de la profilaxis antibiótica como tratamiento preventivo en la septoplastia. Por lo tanto, proponemos obviar el uso de antibióticos mediante la introducción de férulas recubiertas de ZnCl2 antibacterianas y no antibióticas como reemplazo del ISS regular. Hasta donde sabemos, este es el primer estudio de un revestimiento antibacteriano natural para ISS probado in vivo sin la administración de antibióticos.

En el presente estudio, examinamos la utilización de férulas nasales recubiertas de ZnCl2 como tratamiento antibacteriano preventivo contra infecciones posteriores a la cirugía de septoplastia, tanto in vitro como in vivo. En nuestro estudio, encontramos (1) una disminución en el crecimiento bacteriano entre los pacientes de tratamiento y los pacientes de control de crecimiento negativo cuando se colocaron férulas recubiertas de ZnCl2 en la flora nasal de los pacientes sin el uso de antibióticos profilácticos y (2) ZnCl2 fue capaz de inhibir el crecimiento bacteriano de patógenos considerados peligrosos bacterias resistentes a los antibióticos.

Un hallazgo importante de este estudio es que el ZnCl2 pudo inhibir el crecimiento de biopelículas de los tres patógenos clínicamente aislados, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa y Enterobacter aerogenes, que la OMS considera que son grandes amenazas para los humanos como bacterias resistentes a los antibióticos y fueron dado el más alto "estado de prioridad" en cuanto a la urgencia de encontrar nuevos antibióticos contra ellos34. Si bien se inhibió el crecimiento de biopelículas de todos los patógenos probados, se necesitaron concentraciones más altas de ZnCl2 para las bacterias gramnegativas que para las bacterias grampositivas. Por lo tanto, el crecimiento de biopelículas de Staphylococcus aureus grampositivos se inhibió con concentraciones más bajas de ZnCl2 de 0,9 mM a 1,0 mM, mientras que la inhibición del crecimiento de biopelículas en Pseudomonas aeruginosa y Enterobacter aerogenes gramnegativos requirió concentraciones más altas de ZnCl2 de 2,0 mM a 4,0 mM (Tabla 1) . Este hallazgo no sorprende, ya que las bacterias gramnegativas son más resistentes que las bacterias grampositivas, y solo una porción muy pequeña de los compuestos desarrollados contra las bacterias grampositivas tiene actividad contra las bacterias gramnegativas35. Por lo tanto, la capacidad de ZnCl2 para inhibir bacterias grampositivas y gramnegativas es un hallazgo importante de este estudio.

Los resultados in vitro mostraron una disminución significativa (p < 0,001) del 55 al 70 % en la formación de biopelículas de bacterias clínicas en las férulas recubiertas de ZnCl2 en comparación con el control de crecimiento positivo de las férulas no recubiertas de ZnCl2 (datos no mostrados). La inhibición duró las 168 h completas de la prueba, lo que demuestra una posible inhibición eficaz del crecimiento de biopelículas en las férulas durante su estadía de una semana en las cavidades nasales de los pacientes. Las férulas recubiertas de polímero, sin ZnCl2, y las férulas comercializadas sin recubrimiento no mostraron diferencias significativas en la formación de biopelículas en las dos férulas diferentes, lo que sugiere que la estructura de la superficie del recubrimiento de polímero no tuvo un efecto significativo en la capacidad de las bacterias para adherirse a la superficie. Antes de las pruebas de eficacia in vivo, se realizó una evaluación de la toxicidad en ratas, donde no encontramos signos clínicos patológicos ni diferencias histológicas en la mucosa nasal entre el grupo de tratamiento con férula recubierta de ZnCl2 y el grupo de control con férula no recubierta de ZnCl2 (datos no mostrados). ).

Cuando se descartó la toxicidad, continuamos examinando la eficacia in vivo mediante la inserción de férulas recubiertas de ZnCl2 en las cavidades nasales de tres pacientes. Para obtener una evaluación cuantitativa, en lugar de cualitativa, realizamos un examen microscópico de las férulas utilizando CLSM. Aunque no fue significativamente diferente entre todos los pacientes, la capacidad de las bacterias para adherirse a las superficies de las férulas recubiertas con ZnCl2 fue menor que en las férulas regulares no recubiertas con ZnCl2 obtenidas de pacientes que recibieron tratamiento antibiótico profiláctico, lo que representa un control de crecimiento negativo (Fig. 5). Sí encontramos, sin embargo, una disminución significativa (p < 0,05) de 66-72% en la intensidad de señal media, cuantificando la cantidad de masa de biopelícula, entre el paciente de control 1 y los tres pacientes de tratamiento y una disminución no significativa de 57– 64 % en la cantidad de masa de biopelícula entre los tres pacientes de tratamiento y el paciente de control 2. Esto es de esperar, ya que la probabilidad de que ocurra una infección relacionada con la biopelícula en la superficie de un implante polimérico es de entre 65 y 80 %36. Sin embargo, aunque las bacterias pudieron adherirse a la superficie, el recubrimiento de ZnCl2 inhibió el crecimiento de biopelículas en las superficies de las férulas durante la estancia de una semana en las cavidades nasales de los pacientes, lo que resultó en un tratamiento eficaz contra las infecciones relacionadas con la inserción de ISS sin necesidad de para antibióticos profilácticos, siendo el tratamiento al menos tan efectivo como con antibióticos.

En conclusión, a partir de nuestro estudio preliminar, parece que ZnCl2 es una solución natural, efectiva y económica que puede inhibir el crecimiento de biopelículas de patógenos que se consideran peligrosos como bacterias resistentes a los antibióticos, al tiempo que evita el uso de una terapia antibiótica profiláctica después de la inserción de ISS. como parte de la cirugía de septoplastia. Se debe tener en cuenta que, aunque estadísticamente significativo, para implementar esta solución en la práctica clínica, se debe examinar un mayor número de sujetos y se deben realizar mejoras técnicas en el recubrimiento (distribución más uniforme, mayor facilidad de uso, mayor duración del recubrimiento). ).

Las bacterias utilizadas en este estudio se obtuvieron del departamento de microbiología del Hospital Hasharon (Petah Tikvah 4937211, Israel), se aislaron y se mantuvieron a -80 °C. Todas las bacterias se aislaron de la flora nasal de pacientes tratados y no tratados con antibióticos tras la retirada del ISS (tabla 2). Todas las cepas se propagaron en caldo de lisogenia (LB) (Difco) o en medio LB sólido que comprendía Bacto-Agar al 1,5 % (Difco). El caldo LB contenía, por litro, 10 g de triptona, 5 g de extracto de levadura y 5 g de cloruro de sodio (NaCl). Para el crecimiento de rutina, cultivamos cada cepa en LB sólido durante 24 h a 37 °C. Posteriormente, se preparó un cultivo iniciador inoculando una colonia de cada cepa en 5 mL de LB líquido. Luego, los cultivos iniciadores se incubaron durante la noche a 37 °C mientras se agitaban a 100 rpm. Luego, el iniciador se incubó más o se diluyó en el caldo hasta que se obtuvo una DO600 nm de 0,50, se midió usando espectrofotometría (WPA CO8000, Biochrom, Cambridge, Reino Unido) y luego se diluyó 1:100 en el medio experimental relevante. Para el crecimiento planctónico, utilizamos LB líquido, y para el crecimiento de biopelículas, preparamos LBGM complementando LB con glicerol al 1 % (v/v) y sulfato de manganeso 0,1 mM (MnSO4)33.

La identificación de la cepa se logró mediante el uso del método de secuenciación del ARN ribosómico 16S37 utilizando el microkit de limpieza de ADN y extracción en gel GeneJET (Thermo Scientific) y los cebadores 27F y 1492R38. La secuenciación estándar de ADN de las muestras fue realizada por la Instalación de Tecnologías Genómicas en el Instituto Alexander Silberman de Ciencias de la Vida, Universidad Hebrea de Jerusalén. Para Staphylococcus aureus y Enterobacter aerogenes, una DO600 nm de 0,50 ≈ 1 × 108 UFC/ml, y para Pseudomonas aeruginosa, una DO600 nm de 0,50 ≈ 1,5 × 108 UFC/ml.

El cloruro de zinc (ZnCl2) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MI, EE. UU.) se utilizó como sustancia antibacteriana en nuestro estudio en una solución concentrada 1 M que se agregó al medio de crecimiento en diferentes diluciones hasta alcanzar la variedad deseada de final. concentraciones

Las férulas nasales recubiertas utilizadas en este estudio se obtuvieron del laboratorio del profesor Michael Friedman (Escuela de Farmacia, Facultad de Medicina, Universidad Hebrea de Jerusalén). Se cargó polietilenglicol 400, un volumen de disolvente deseado de solución acuosa de etanol, en un vaso de precipitados para productos químicos de un tamaño adecuado equipado con una varilla agitadora magnética. Los contenidos se mezclaron a aproximadamente 35 °C a una velocidad que produjo un vórtice estable. A continuación, se añadió gradualmente Klucel™ hidroxipropilcelulosa HF para garantizar una humectación adecuada y se mezcló a una temperatura de 25 °C a 35 °C hasta la disolución completa de los polímeros, evaluada visualmente en un portaobjetos de vidrio transparente. Luego se añadió ZnCl2 a la solución de polímero y se mezcló hasta la disolución o hasta que se obtuvo una dispersión estable. Las propiedades de flujo se evaluaron descargando 1 ml de la formulación de una jeringa sin aguja. El recubrimiento finalmente contenía 0,3 g de polietilenglicol 400, 0,7 g de Klucel™ hidroxipropilcelulosa HF y 0,5 g de ZnCl2 en 30 cc de etanol/H2O 9:1 y 1,5 mL de H2O. Se recubrieron férulas de silicona (férula nasal Grimaldi, N5, Exmoor Plastics Ltd, Reino Unido) en cada lado pipeteando la formulación, esparciendo uniformemente y luego secando. Se eliminó el exceso de recubrimiento o se agregó un recubrimiento adicional para asegurar un peso uniforme del recubrimiento. Antes de realizar los experimentos con las piezas de la férula, se desinfectaron con radiación ultravioleta (UV) durante 1,5 h en cada lado.

MIC se define como la concentración más baja de una sustancia que inhibe el crecimiento visible de un cultivo planctónico. La MBC se define como la concentración más baja de una sustancia que reduce el inóculo inicial de un cultivo planctónico en un 99,9%39. Para determinar el valor de MIC, utilizamos el método de dilución en caldo en las cepas bacterianas examinadas, como se describe en Balouiri et al.40 con ligeras modificaciones. Brevemente, se generó un cultivo iniciador para cada aislado y luego se diluyó a 1:100 en una placa de 48 pocillos, y se añadió ZnCl2 a cada pocillo en concentraciones graduales, comenzando con 0,5 mM y hasta 10 mM. A continuación, las placas se incubaron durante la noche a 37 °C y se examinó el crecimiento a la mañana siguiente. La CIM se determinó de acuerdo a los pocillos en los que no hubo crecimiento visible, y la concentración de ZnCl2 fue la más baja. Para determinar el valor de MBC, 100 µL de cada uno de los pocillos con concentraciones superiores al valor de MIC determinado se sembraron en LB sólido durante 24 h a 37 °C, como se describió anteriormente40. Luego, se contaron las células vivas (UFC/mL) de las placas y se determinaron los valores de MBC como la concentración más baja a la que se eliminó el 99,9 % del inóculo inicial. Para concentraciones dentro del rango probado en el que no se cumplieron estos criterios, MIC y MBC se determinaron como no encontrados (NF). Se realizó un ensayo en tres experimentos independientes, cada uno realizado por triplicado para cada concentración de ZnCl2.

BPC se define como la concentración más baja de una sustancia antibacteriana que causa una reducción de 1 log en el crecimiento de biopelículas a OD650 nm, con exposición simultánea de la inoculación bacteriana y la sustancia antibacteriana39. Para determinar el valor de BPC, realizamos un ensayo de susceptibilidad como se describió anteriormente39, con algunos cambios. Se diluyó un iniciador a 1:100 en medio LBGM y se colocó en una placa de 96 pocillos (de fondo redondo, Nunc™) junto con concentraciones graduales de ZnCl2 de 0,1 a 0,9 mM en pasos de 0,1 mM y de 1,0 a 4,0 mM en pasos de 1,0 mM. pasos, con cuatro pocillos para cada concentración de ZnCl2. Después de 24 h de incubación a 37 °C en condiciones estáticas, se transfirieron 100 µL de cada pocillo a una nueva placa de 96 pocillos (de fondo plano, Nunc™) y se midió la DO595 nm utilizando un lector de placas (ELx808™, Instrumentos Bio-Tek, Vermont, EE. UU.). El BPC se determinó de acuerdo con los pozos con la concentración más baja que produjo al menos una diferencia de 1 logaritmo en el crecimiento. Se realizó un ensayo en tres experimentos independientes, cada uno realizado por cuadruplicado para cada concentración de ZnCl2.

Se colocaron piezas de un cm2 de férulas recubiertas con ZnCl2 en una placa de 24 pocillos (Nunc™), junto con piezas de férulas recubiertas sin ZnCl2 y férulas sin recubrir como control positivo del crecimiento. Diluimos un iniciador generado a 1:100 en medio LBGM y luego pipeteamos 150 µL en el lado superior de cada una de las piezas de férulas recubiertas. Posteriormente, la placa se incubó en condiciones estáticas a 37 °C, y las piezas de la férula se revisaron para detectar el crecimiento de biopelículas después de 10 h, 24 h, 48 h, 72 h y 168 h. La cuantificación de biopelículas se logró mediante el ensayo de formación de biopelículas en placa de microtitulación, como se usó anteriormente41, con modificaciones; las piezas de la férula se lavaron dos veces en agua destilada para eliminar las células planctónicas y luego se incubaron en una solución CV al 0,1 % (p/v) durante 15 min. Posteriormente, el residuo de la mancha se lavó con agua destilada y las piezas teñidas se dejaron secar durante la noche a temperatura ambiente (TA). A continuación, agregamos ácido acético al 30% para solubilizar el CV durante 15 min (TA). A continuación, los extractos se colocaron en una nueva placa de 96 pocillos de fondo plano (Nunc™) y se midieron con un lector de placas (ELx808™, Bio-Tek Instruments, Vermont, EE. UU.).

Para la visualización microscópica del crecimiento de biopelículas en las superficies de las férulas, colocamos piezas de 1 cm2 de férulas sin recubrimiento, férulas recubiertas sin ZnCl2 y férulas recubiertas con ZnCl2 en una placa de 24 pocillos (Numc™). Diluimos un iniciador generado a 1:100 en medio LBGM y luego pipeteamos 150 µL en el lado superior de cada una de las piezas de la férula. Luego, la placa se incubó en condiciones estáticas a 37 °C. Después de 24 h de incubación, se pipetearon de nuevo 150 µl de iniciador diluido fresco en el lado superior de la superficie de cada férula y la placa se incubó durante otras 24 h a 37 °C durante un total de 48 h. Posteriormente, las piezas fueron lavadas y fijadas según la cepa bacteriana, como se describió anteriormente42, con ligeras modificaciones como se detalla a continuación. Se usó una solución de glutaraldehído al 4 % como fijador diluyendo una reserva de glutaraldehído al 8 % (SPI Chem, Pensilvania, EE. UU.) 1:1 con agua bidestilada (DDW). Se prefirió una solución de glutaraldehído al 4% a una solución común de glutaraldehído al 2,5% y formaldehído al 2,5%, ya que el experimento se centró en la morfología de la superficie en lugar de la estructura interna. Dado que el etanol provocó la eliminación total de la lámina de biopelícula de base acuosa, la deshidratación posterior a la fijación se realizó mediante secado al aire.

Para Staphylococcus aureus, las piezas fueron fijadas inmediatamente después del período de incubación, sin lavados previos, mediante la adición de 300 µL de glutaraldehído al 4% a cada pocillo. Después de una hora de incubación, las piezas se lavaron una vez en 400 µL de solución salina tamponada con fosfato (PBS) y una vez en 400 µL de DDW, 10 min cada una en condiciones estáticas (RT). Finalmente, las piezas se dejaron secar al aire durante la noche (TA). Las muestras se mantuvieron a 4 °C hasta la evaluación microscópica.

Para Enterobacter aerogenes y Pseudomonas aeruginosa, después de 48 h de incubación, las células sueltas se eliminaron lavando las piezas dos veces en 400 µL de PBS y una vez en 400 µL de DDW, 10 min cada una en condiciones estáticas (RT). Luego, las piezas se fijaron agregando 300 µL de glutaraldehído al 4% a cada pocillo durante una hora de incubación en condiciones estáticas (TA). Después de la incubación, las piezas se lavaron dos veces en 400 µL de DDW, 10 min cada una, en condiciones estáticas (TA). Finalmente, las piezas se dejaron secar al aire durante la noche (TA). Las muestras se mantuvieron a 4 °C hasta la evaluación microscópica.

Antes de la evaluación microscópica, todas las piezas de la férula, independientemente de la cepa bacteriana, se cortaron en cuatro piezas iguales, se recubrieron con una capa de oro de 1 nm (Au/Pd) (QUORUM Q150T ES) y luego se visualizaron por SEM (JEOL, JSM-7800F, Tokio, Japón Microscopio electrónico de barrido de emisión de campo Schottky). Las imágenes se tomaron con un voltaje de aceleración de 2 kV con aumentos de 1000, 10000 y 20000.

Para calificar la eficacia del tratamiento, las imágenes se caracterizaron como carga microbiana alta (Fig. 5a), carga microbiana media (Fig. 6k) y carga microbiana baja (Fig. 5b).

Para la visualización CLSM del crecimiento de biopelículas en las superficies de la férula, se llevó a cabo el mismo protocolo de crecimiento y fijación que en la preparación para la evaluación de la eficacia de la férula recubierta frente a la formación de biopelículas mediante SEM. Antes de la evaluación del CLSM, las piezas de la férula fijada se tiñeron con yoduro de propidio (PI) (renio) diluyendo 130 µL de PI en 870 µL de DDW para crear 1 ml de solución madre, almacenada en papel de aluminio a 4 °C y luego diluyendo la solución madre de PI 1:10 en DDW. Luego, se agregaron 300 µL de la solución de PI diluido a cada pocillo. A esto le siguió una incubación durante 30 min mientras se cubría con papel de aluminio (TA). Después de la incubación, las piezas de la férula se lavaron con 400 µL de PBS y se dejaron con la solución de PBS a 4 °C, cubiertas con papel de aluminio hasta la evaluación microscópica, como se describió anteriormente42. Se prefirió PI a CV en base a la experiencia anterior con catéteres en nuestro laboratorio, y dado que todas las bacterias no estaban vivas después del paso de fijación.

CLSM (LEICA SP8) evaluó el crecimiento de biopelículas en las superficies de las férulas y midió la intensidad de la fluorescencia utilizando un objetivo seco de 20x/0,7 NA con factor de zoom de 1,28, excitación de 561 nm y emisión de 600–650 nm, con Ganancia de PMT de 850 [V]. Formato de píxel 1024 × 1024, tamaño de vóxel 0,446 × 0,446 × 2 µm (X, Y, Z, respectivamente) (Información complementaria).

El procesamiento y análisis de imágenes se realizaron en los siguientes pasos: (1) el archivo '.lif' guardado se guardó como archivos '.tif' individuales, con una macro de Fiji "ImageJ_Export-LIF-as-Individual-Images-master_pmascalchi"43, y (2) los archivos fueron procesados ​​y analizados con una segunda macro "area_fraction_analysis.ijm"44, en ocho áreas diferentes por muestra analizada.

Investigamos la seguridad del uso de férulas recubiertas de ZnCl2 en la prevención de la infección de la mucosa nasal en ratas. El estudio de seguridad fue aprobado por el Comité de Ética de Beilinson y se llevó a cabo en el laboratorio de investigación experimental Frankel en el Centro de Investigación Médica Felsenstein (Petah Tikva, 4,941,492, Israel). Dieciocho ratas Sprague-Dawley (SD) machos y hembras se utilizaron en este estudio y se mantuvieron de acuerdo con las pautas estándar. Se cortaron una férula nasal interna de silicona (INS) y una férula recubierta de silicona ZnCl2 (Z-INS) en piezas de 1 mm × 0,85 mm × 7 mm. Las ratas se distribuyeron aleatoriamente en un grupo de control, implantado con INS (n = 6), y un grupo de tratamiento, implantado con Z-INS (n = 12). Las férulas se colocaron en las fosas nasales derechas de las ratas durante 7 días. Luego, los tejidos fueron descalcificados, recortados, embebidos en parafina, seccionados y enviados para procesamiento histológico, realizado por la unidad de investigación de PATHO-LAB Diagnostics Ltd. (Ness Ziona, Israel). La evaluación histológica se obtuvo utilizando un microscopio óptico BX43 Olympus y una cámara digital DP21 Olympus con el software Olympus cellSens Entry 1.13. Las muestras se evaluaron de acuerdo con parámetros conocidos, como se describe en Şevik Eliçora et al.45.

Después de la cirugía nasal, los cirujanos del Hospital Hasharon (Kakal Street 7, Petah Tikva, Israel) insertaron férulas recubiertas de ZnCl2 en las cavidades nasales de tres pacientes en lugar de las férulas convencionales sin recubrimiento. Las férulas se dejaron en la nariz de los pacientes durante 7 días después de la cirugía y luego se retiraron, se lavaron en PBS y se fijaron con glutaraldehído al 4%. Las férulas se dejaron reposar durante una hora y luego se lavaron dos veces durante 10 min cada una en PBS en condiciones estáticas (RT). Las férulas se dejaron secar al aire durante la noche (RT) y finalmente se mantuvieron a 4 °C hasta la evaluación microscópica.

Los pacientes que participaron en el estudio se abstuvieron de usar medicamentos regulares, tratamiento antibiótico, aerosoles nasales y agentes anticorrosivos nasales durante el mes previo a la cirugía.

El comité de ética del Centro Médico Rabin (Helsinki) otorgó la aprobación ética para el estudio en animales y para todos los protocolos experimentales para la investigación sobre los efectos de los dispositivos recubiertos de zinc de liberación lenta a base de polímeros para la prevención de infecciones en modelos animales. Número de aprobación: 021219 por un período de 4 años, a partir del 12/01/19. Todos los métodos se llevaron a cabo de acuerdo con las pautas y regulaciones pertinentes y se informan de acuerdo con las pautas de ARRIVE.

El comité de ética del Centro Médico Rabin (Helsinki) otorgó la aprobación ética para el estudio en humanos para un ensayo de fase 1 en humanos para la investigación sobre el uso de férulas recubiertas de ZnCl2 para prevenir el crecimiento bacteriano en las férulas nasales. Número de aprobación: 0374-19-RMC por un período de 1 año, a partir del 23/9/2021. Toda la investigación se realizó de acuerdo con las pautas y regulaciones pertinentes, y se obtuvo el consentimiento informado de todos los sujetos y/o sus tutores legales.

Los datos numéricos obtenidos se analizaron estadísticamente por medio de ANOVA siguiendo una prueba t post hoc utilizando el software JMP con valores de p significativos < 0,05. Los resultados se basan en tres experimentos biológicos realizados por triplicado.

Los datos que respaldan los hallazgos de este estudio están disponibles del autor correspondiente a pedido razonable. Los conjuntos de datos generados y/o analizados durante el estudio actual están disponibles en el depósito de NIH, números de acceso: OQ195154, OQ195155, OQ195156, OQ195157, OQ195158 y OQ195159.

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Este trabajo fue apoyado financieramente por la Autoridad de Innovación de Israel (70017).

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Neumáticos Noa Noah y Ram

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Eran Lavy

FACSI-Facultad de Agricultura Centro de Imágenes Científicas. Facultad Robert H. Smith de Agricultura, Alimentación y Medio Ambiente, Universidad Hebrea de Jerusalén, Rehovot, Israel

Einat Zelinger

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NN escribió el texto principal del manuscrito, EL coordinó el proyecto, RR diseñó y administró el proyecto, MF y DK prepararon muestras de férulas, EZ realizó microscopía electrónica y confocal, AR y DY realizaron seguimiento clínico y ER realizó cirugía. Todos los autores revisaron el manuscrito.

Correspondencia a Ram Reifen.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Reimpresiones y permisos

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Recibido: 02 enero 2023

Aceptado: 11 de mayo de 2023

Publicado: 23 mayo 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-35069-9

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