Reducción simultánea de sulfatos y nitratos en sedimentos costeros

Aug 16, 2023

ISME Communications volumen 3, Número de artículo: 17 (2023) Citar este artículo

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Las condiciones redox oscilantes que caracterizan los sedimentos arenosos costeros fomentan comunidades microbianas capaces de respirar oxígeno y nitrato simultáneamente, lo que aumenta el potencial de remineralización de materia orgánica, pérdida de nitrógeno (N) y emisiones del gas de efecto invernadero óxido nitroso. Se desconoce en qué medida estas condiciones también conducen a superposiciones entre la respiración disimilatoria de nitrato y sulfato. Aquí, mostramos que la respiración de sulfato y nitrato ocurre simultáneamente en los sedimentos superficiales de una llanura de arena intermareal. Además, encontramos fuertes correlaciones entre la reducción disimilatoria de nitrito a amonio (DNRA) y las tasas de reducción de sulfato. Hasta ahora, se suponía que los ciclos del nitrógeno y el azufre estaban vinculados principalmente en los sedimentos marinos por la actividad de los oxidantes de sulfuro reductores de nitrato. Sin embargo, los análisis transcriptómicos revelaron que el gen marcador funcional para DNRA (nrfA) estaba más asociado con microorganismos conocidos por reducir el sulfato en lugar de oxidar el sulfuro. Nuestros resultados sugieren que cuando se suministra nitrato a la comunidad de sedimentos tras la inundación de las mareas, parte de la comunidad reductora de sulfato puede cambiar la estrategia respiratoria a DNRA. Por lo tanto, los aumentos en la tasa de reducción de sulfato in situ pueden dar como resultado un DNRA mejorado y tasas de desnitrificación reducidas. Curiosamente, el cambio de desnitrificación a DNRA no influyó en la cantidad de N2O producido por la comunidad de desnitrificación. Nuestros resultados implican que los microorganismos considerados clásicamente como reductores de sulfato controlan el potencial de DNRA dentro de los sedimentos costeros cuando las condiciones redox oscilan y, por lo tanto, retienen el amonio que de otro modo sería eliminado por desnitrificación, lo que exacerba la eutrofización.

Los sedimentos arenosos permeables que bordean las costas actúan como filtros biocatalíticos altamente efectivos que remineralizan el carbono orgánico y eliminan el nitrógeno fijado a través de la desnitrificación [1,2,3,4,5]. Las comunidades microbianas que catalizan las transformaciones biogeoquímicas en sedimentos permeables están sujetas a frecuentes oscilaciones en el suministro de aceptores de electrones, donde la profundidad a la que el oxígeno y el nitrato penetran en el sedimento puede cambiar en minutos [6,7,8,9,10]. Estas oscilaciones se deben a cambios en la advección de los poros como resultado de cambios en las corrientes de marea, las olas, la forma de las superficies de los lechos de arena y la bioturbación y el riego biológico [4, 11, 12]. En escalas de tiempo más largas, las corrientes altas y las tormentas movilizan los sedimentos arenosos, redistribuyendo los granos de arena y sus microorganismos adheridos entre las capas de sedimentos [13,14,15,16,17].

Muchos de los microorganismos dentro de los sedimentos permeables parecen estar adaptados a las condiciones óxicas y anóxicas oscilantes [18]. Tales adaptaciones incluyen la especialización metabólica de los organismos involucrados en el proceso de desnitrificación, lo que conduce a la eliminación de nitrato pero también a emisiones sustanciales de óxido nitroso [19, 20]. Además, los cambios rápidos en las condiciones redox y la disponibilidad del aceptor de electrones dan como resultado microorganismos que utilizan simultáneamente oxidasas terminales y N-reductasas. Esto conduce a la coexistencia de procesos de desnitrificación y respiración aeróbica, que suelen estar separados espacial o temporalmente en sedimentos de difusión limitada [10, 18, 19]. Potencialmente, la reducción de sulfato y la reducción de nitrato también pueden ocurrir simultáneamente en sedimentos superficiales donde el nitrato se suministra intermitentemente [21], o incluso la reducción de sulfato y la respiración de oxígeno. Sin embargo, las posibles interacciones entre la reducción simultánea de sulfato y las vías de reducción de nitrato en sedimentos permeables siguen sin explorarse.

Por lo general, los microorganismos en los sedimentos marinos emplean diferentes aceptores de electrones a lo largo de la profundidad, en gran medida de acuerdo con su rendimiento energético decreciente, lo que a menudo conduce a una aparente separación espacial de la reducción de sulfato de la reducción de nitrato [22,23,24]. Es probable que esta separación se mantenga por exclusión competitiva, en la que los reductores de N superan a los reductores de sulfato porque conservan más energía por electrón donado [24,25,26,27]. Además, la acumulación de nitrito, que se ha observado que ocurre debido a la especialización metabólica en las arenas [20], también puede inhibir competitivamente la sulfito reductasa, una enzima crucial para la reducción del sulfato [28, 29]. Sin embargo, la reducción de sulfato y la desnitrificación pueden vincularse a través de la actividad microbiana [22]. Por ejemplo, los microbios pueden salvar la distancia entre los sedimentos sulfurosos y los ricos en nitratos mediante la migración [30] o los pili electrogénicos y realizar la oxidación del sulfuro junto con la reducción del nitrato [31, 32]. Cuando la reducción de nitrato se combina con la oxidación completa de sulfuro, la reducción de sulfato puede subestimarse [33,34,35,36].

Varias líneas de evidencia sugieren que la reducción de sulfato en sedimentos permeables intermareales debería ser tolerante al nitrato. Los reductores de sulfato están presentes y son muy activos en las capas superiores del sedimento, aunque esta área está frecuentemente expuesta tanto al nitrato como al oxígeno [6, 37,38,39,40]. Un estudio reciente ha demostrado que las bacterias reductoras de sulfato tienen mayores tasas de asimilación de acetato en la capa de sedimento superior que en las capas de sedimento más profundas [41]. Además, en los enriquecimientos con quimiostatos de sedimentos permeables intermareales, el sulfuro producido a partir de reductores de sulfato alimentó las poblaciones de desnitrificantes y amonificadores [42, 43]. Juntos, estos estudios sugieren que los reductores de sulfato en sedimentos intermareales permeables pueden coexistir con microorganismos desnitrificantes y podrían adaptarse, en lugar de ser inhibidos por, la exposición frecuente a nitrato e incluso oxígeno.

La coexistencia de la respiración de nitratos y sulfatos tiene el potencial de afectar las vías de eliminación de N. Por ejemplo, se había predicho anteriormente que la presencia de sulfuro conduciría a mayores emisiones de óxido nitroso durante la desnitrificación [44] y podría aumentar las emisiones de este potente gas de efecto invernadero de los sedimentos permeables. La ocurrencia de reducción de sulfato también podría alterar el equilibrio entre la desnitrificación y la reducción disimilatoria de nitrato/nitrito a amonio (DNRA), un proceso que retiene el N fijo en los sistemas costeros en lugar de eliminarlo. Por ejemplo, la oxidación del sulfuro producido por la reducción del sulfato se ha relacionado recientemente con la comunidad DNRA en lugar de la comunidad desnitrificante en los sedimentos de las marismas costeras [45]. El vínculo entre la respiración de sulfato y nitrato también podría ser más directo, ya que muchos organismos que tradicionalmente se consideran bacterias reductoras de sulfato también tienen el potencial de reducir el nitrito a amonio. De estos, se ha demostrado que algunos cambian a DNRA canónico cuando el nitrato está disponible y usan la vía para apoyar el crecimiento [46, 47], mientras que otros continúan reduciendo preferentemente el sulfato en presencia de compuestos N oxidados [48,49,50 ]. La reducción de nitrito a amoníaco también puede ser catalizada por la propia sulfito reductasa, aunque es probable que esta conversión no tenga ningún beneficio fisiológico [28, 29]. Los organismos como Desulfovibrio vulgaris pueden prevenir esta inhibición competitiva de la sulfito reductasa a través de la expresión constitutiva de la nitrito reductasa del citocromo c periplásmico (Nrf) para eliminar el nitrito, aunque existen informes contrastantes sobre si esto también está relacionado con la generación de energía [51, 52] .

En este estudio planteamos la hipótesis de que las condiciones dinámicas típicas de los sedimentos permeables intermareales conducen a la respiración simultánea de nitratos y sulfatos, análoga a las observaciones previas de respiración aeróbica y anaeróbica simultánea [18]. Además, investigamos si la concurrencia de la respiración de nitratos y sulfatos afecta el equilibrio de la desnitrificación, la producción de DNRA y N2O y, por lo tanto, el funcionamiento de las arenas como filtros biocatalíticos. Para probar esto, las tasas de reducción de nitrato y sulfato se determinaron simultáneamente en sedimentos recién recolectados de los dos centímetros superiores del llano de arena intermareal de Janssand en el Mar del Norte. Posteriormente, se utilizaron núcleos de flujo continuo compuestos por los mismos sedimentos para obtener información mecánica sobre cómo las oscilaciones en la disponibilidad de NO3 causadas típicamente por las corrientes de marea o las tormentas afectan el equilibrio de desnitrificación, DNRA, producción de N2O y reducción de sulfato. Encontramos fuertes correlaciones entre el DNRA y las tasas de reducción de sulfato, lo que indica un vínculo estrecho entre los dos ciclos. Para obtener más información sobre el metabolismo potencial de los microorganismos responsables de este enlace, examinamos las afiliaciones filogenéticas de las transcripciones asociadas con nrfA, el gen marcador clave para DNRA.

Se investigaron las superposiciones espaciales y temporales entre la desnitrificación, el DNRA y la reducción de sulfato en sedimentos costeros permeables utilizando sedimentos superficiales frescos y sedimentos superficiales acondicionados durante cinco días con diferentes suministros de aceptores de electrones. El sedimento se acondicionó inmediatamente después de la recolección en octubre de 2018 usando diferentes regímenes de nitrato diseñados para imitar la variabilidad que ocurre en diferentes horizontes de sedimentos in situ.

En la planicie de marea, el oxígeno y el nitrato pueden penetrar a profundidades de 5 a 10 cm durante la marea alta, pero se consumen rápidamente cuando la marea retrocede, por lo que solo están presentes en los mm superiores [6, 53]. En escalas de tiempo más largas, la redistribución de sedimentos puede enterrar los microorganismos que están adheridos a los granos de arena más profundamente en el plano de arena, o traer granos de arena desde profundidades más profundas y anóxicas más estables a la superficie (Fig. 1A) [13, 14]. Para imitar esta variabilidad en la disponibilidad del aceptor de electrones, se suministraron nitrato a dos núcleos de sedimento de flujo continuo durante 6 h, seguido de un período de 6 h sin nitrato, similar a la capa superior del banco de arena (Fig. 1A). En uno de estos núcleos, el flujo se mantuvo constantemente para eliminar los productos metabólicos como el sulfuro y el Fe II (Variable Redox / Eliminación de Producto), mientras que en el otro núcleo se detuvo el flujo y se pudieron acumular productos metabólicos (Variable Redox / Product Accumulation). ) (Fig. 1B). Para imitar las condiciones en las capas superiores y más profundas del sedimento, se suministró constantemente un tercer núcleo con agua de mar rica en nitratos (Nitrate Replete), mientras que un cuarto se suministró constantemente con agua de mar libre de nitratos (Nitrate Deplete). Todos los núcleos se mantuvieron anóxicos durante todo el período de acondicionamiento para aislar el efecto de las variaciones de nitrato de las causadas por el oxígeno.

A Cambios en la disponibilidad de electrones in situ. Esquema de los cambios que ocurren en escalas de tiempo de una hora a una diaria en las planicies de arena intermareales. Cuando la marea está alta, la advección puede transportar O2 y NO3- a profundidades de hasta 5 a 10 cm. Cuando baja la marea, ambos se consumen rápidamente y solo están presentes en la parte superior de mm a cm. Cuando las corrientes de fondo se vuelven lo suficientemente fuertes, o cuando la acción de las olas es alta, las estructuras de sedimentos ondulados comienzan a migrar, redistribuyendo la arena y exponiendo sedimentos más profundos que se han agotado en NO3 durante períodos de tiempo más prolongados. B Suministro de aceptor de electrones en los sedimentos acondicionados: además de realizar mediciones de velocidad en sedimentos recién recolectados, los sedimentos se expusieron a diferentes condiciones durante cinco días en reactores de flujo continuo alimentados con agua anóxica.

Durante el período de acondicionamiento de cinco días, el nitrato proporcionado a los núcleos se consumió, lo que indica que probablemente se estaba produciendo una reducción de nitrato o, alternativamente, había sido almacenado por la comunidad de diatomeas del sedimento [54]. No se detectó sulfuro libre en el agua intersticial a la salida de ninguno de los cuatro núcleos, sin embargo, se midieron concentraciones sustanciales de Fe II disuelto (Fig. 2 complementaria). La liberación de Fe II combinada con la rápida formación de puntos negros y sedimentos grises (indicativos de la formación de sulfuro de hierro) en núcleos que no reciben nitrato (Fig. 1 complementaria), sugirió la ocurrencia de una reducción sustancial de sulfato en los núcleos [55].

Al final del período de acondicionamiento, se submuestreó el sedimento del centro de los núcleos en una campana anaeróbica y se colocaron 2 cm3 de sedimento en múltiples viales de vidrio de 12 cm3 que se llenaron hasta el tope con agua de mar filtrada anóxica antes de tapar para crear lodos. Luego se determinaron las tasas de reducción de sulfato y consumo de nitrato en las lechadas en incubaciones enmendadas con trazador de sulfato 35S y sin nitrato (incubaciones no enmendadas), o sulfato 35S y 15N-NO3- (incubaciones enmendadas con NO3). La reducción de nitrato se determinó en lodos que recibieron 15N-NO3- pero ningún trazador 35S. A lo largo del período de incubación, las suspensiones se mezclaron suavemente colocando los viales de vidrio en un tanque giratorio para evitar la formación de micronichos empobrecidos en nitrato.

La reducción de sulfato ocurrió en todos los sedimentos recién recolectados y acondicionados cuando se incubaron sin NO3- (incubaciones no modificadas) (Fig. 2, Tablas complementarias 1–3). Las tasas de reducción de sulfato en sedimentos acondicionados (0.9–11.5 nmol cm−3 sed hr−1) variaron sustancialmente entre núcleos, pero se superpusieron con el rango observado en sedimentos recién recolectados (1.6–3.0 nmol cm−3 sed hr−1) y aquellos medidos previamente en los dos cm superiores de la llanura de arena (0.42–16 nmol cm−3 h−1) [37, 56]. La tasa de reducción de sulfato en el sedimento en la condición Variable Redox/Eliminación del producto (1.8–3.7 nmol cm-3 sed hr-1) fue más similar a la del sedimento fresco, lo que indica que este régimen simuló más de cerca los sedimentos superficiales en la llanura de marea. La ocurrencia de reducción de sulfato en la capa superficial del banco de arena y en todos los sedimentos acondicionados, incluidos aquellos que habían estado expuestos a altas concentraciones de NO3- durante cinco días (250–150 µM NO3- en los núcleos variables) indica fuertemente que los reductores de sulfato en el banco de arena están aclimatados a la presencia recurrente de NO3- y, por lo tanto, la reducción de sulfato es omnipresente en estos sedimentos. Esto es consistente con la observación de una alta absorción de acetato por los reductores de sulfato en el sedimento superficial [41], y con la transcripción continua de genes de reducción de sulfato en quimiostatos que contienen sedimentos de Janssand después de 100 días de exposición continua pero baja a NO3 [42].

Tasas de reducción de sulfato (SRR) de sedimentos enmendados con NO3- (barras negras) o sin NO3- (barras blancas) en nmol cm−3 sed. h−1. La reducción de sulfato comenzó inmediatamente en todas las incubaciones y las tasas se calculan a partir del período de tiempo en el que las tasas fueron lineales. Consulte las tablas complementarias 1 y 2 para conocer las estadísticas asociadas. Todas las tasas tenían un R2 ajustado de al menos 0,85, excepto la condición Redox Variable / Acumulación de Producto, que tenía un R2 de 0,56 cuando se modificaba con NO3-, y de 0,75 sin NO3-. Todas las barras de error representan el error estándar. Las incubaciones de sedimentos acondicionados se realizaron en octubre de 2018.

Sin embargo, las diferencias sustanciales en las tasas de reducción de sulfato entre núcleos incubados con diferentes disponibilidades de NO3 indican que la exposición a nitrato sí tiene cierto control sobre la reducción neta de sulfato. Las tasas fueron 5 veces más altas en el núcleo agotado en nitrato (que no había recibido NO3- durante 5 días) que en el núcleo repleto de nitrato (que había recibido NO3- constantemente durante 5 días) (Fig. 2). En comparación con las tasas in situ, las tasas de reducción de sulfato fueron más bajas en el núcleo repleto de nitratos, y viceversa, fueron más altas en el núcleo agotado en nitratos. Por el contrario, en los sedimentos condicionados por Redox variable, la disponibilidad de NO3 no pudo estar claramente relacionada con los cambios en las tasas de reducción de sulfato. Aunque ambos sedimentos Variable Redox estuvieron expuestos a regímenes de nitrato similares durante el período de acondicionamiento, las tasas de reducción de sulfato fueron tres veces más altas en el núcleo de flujo continuo que tuvo un período de estancamiento de 6 h (Variable Redox / Acumulación de producto) en comparación con el reactor con flujo constante. caudal (Variable Redox / Eliminación de Producto).

En las incubaciones en suspensión enmendadas con 50–60 µM de NO3-, la reducción de sulfato y NO3- procedió simultáneamente tanto en los sedimentos recién recolectados como en los acondicionados (Fig. 3, Fig. 5 complementaria). En combinación con la reducción persistente de sulfato en el sedimento acondicionado con NO3 (donde no se agregó NO3 durante la incubación misma), estos resultados sugieren que las condiciones dinámicas en el banco de arena seleccionan un nivel de fondo de reducción de sulfato constitutivo en sedimentos anóxicos permeables de Janssand. , incluso en presencia de un aceptor de electrones termodinámicamente más favorable (NO3-). Estos resultados guardan muchas similitudes con la ocurrencia de desnitrificación en presencia de oxígeno, observada previamente en estos sedimentos [10, 18].

15NH4+ (círculos de color gris claro) y la producción de 15N-N2 (círculos de color púrpura) y la reducción total de sulfato (cuadrados negros) se trazan para incubaciones paralelas modificadas con nitrato de sedimentos superficiales recolectados en octubre de 2018 (A) y mayo de 2019 (B). Cada punto representa una medición de una incubación separada. Tenga en cuenta las diferentes barras de escala.

La reducción de sulfato siempre ocurría en presencia de nitrato, aunque a una tasa de ~20 a 60 % de la observada en las lechadas no enmendadas (Fig. 2). Existen al menos tres mecanismos que pueden explicar esta aparente disminución de las tasas de reducción de sulfato en presencia de NO3-; (1) inhibición competitiva de la sulfito reductasa por NO2- [29], (2) bacterias reductoras de sulfato cambiando su metabolismo a DNRA [46, 47] y (3) oxidación completa de sulfuro a sulfato junto con reducción de NO3- [57, 58] . Los umbrales informados en los que el NO2- inhibe completamente la reducción de sulfato y/o el crecimiento de bacterias reductoras de sulfato varían mucho (0,04 mM - 10 mM), pero generalmente están por encima de las concentraciones observadas durante nuestras incubaciones, donde las concentraciones de NO2- alcanzaron un máximo de 35 µM (Figs. 3, 4) [27, 59, 60]. Si bien la sulfito reductasa disimilatoria purificada tiene una alta afinidad (aunque un recambio bajo) por el NO2- (Km = 38 µM; kcat = 0,038 mol s-1 mol-1 haem) [29], no hubo una relación obvia entre una acumulación de NO2- y disminución de la reducción de sulfato en las incubaciones (Figuras complementarias 3-5). Por lo tanto, sugerimos que la reoxidación de sulfuro por oxidantes de sulfuro (a veces denominado ciclo de azufre críptico) o los reductores de sulfato que cambian su metabolismo a DNRA son explicaciones más probables de la disminución aparente en la reducción de sulfato con la adición de NO3. Sin embargo, debe tenerse en cuenta que las muestras de reducción de sulfato se procesaron utilizando el método de reducción Cr-II (Roy et al., 2014), que captura los compuestos del estado de oxidación intermedio del sulfuro y del azufre producidos (por ejemplo, pirita, S elemental, tiosulfato, sulfito). ). Como tal, la reoxidación de sulfuro a intermediarios de azufre se incluiría en las determinaciones de la tasa de reducción de sulfato, pero no cualquier sulfuro marcado con 35S que se oxidara rápida y completamente de nuevo a sulfato.

Durante el transcurso de las incubaciones, el 15N-NO3- se redujo a 15N-N2 y 15N-NH4+, lo que indica que cuando había nitrato presente, existía la posibilidad de que ocurriera tanto la desnitrificación como el DNRA dentro del sedimento (Fig. 4A). Sin embargo, la proporción de producción de N2:NH4+ difirió sustancialmente entre los sedimentos después de haber sido acondicionados (Fig. 4B). Por ejemplo, en la condición Repleto de Nitrato, la desnitrificación fue el proceso dominante y la producción de 15N-N2 fue 12 veces mayor que la producción de 15N-NH4+ (Fig. 4). Esta fue mucho más alta que la relación observada en los sedimentos superficiales recién recolectados, donde, como es típico en estos sedimentos, la desnitrificación fue alrededor del doble que la DNRA [54, 61]. La desnitrificación también fue aproximadamente el doble que el DNRA en el sedimento Variable Redox / Eliminación de producto, mientras que en el sedimento Variable Redox / Acumulación de producto, las tasas de desnitrificación y DNRA fueron similares. Dentro del núcleo de agotamiento de nitratos, el DNRA fue marginalmente más alto que la desnitrificación.

A Tasas de producción de N2 (negro) y NH4+ (blanco) en nmol 15N cm−3 sed. en los cuatro sedimentos acondicionados y dos sedimentos superficiales recién recolectados. Todas las barras de error representan el error estándar de las tasas. Todas las tasas se ajustaron a puntos en los que la producción de N2 era aproximadamente lineal, y todas las tasas tienen un R2 de al menos 0,86 (consulte las Tablas complementarias 1 y 2 para conocer las estadísticas asociadas). B Datos normalizados del panel A que muestran el 15N-NO3- convertido en NH4+ o N2 como porcentaje de la tasa total de conversión de 15N-NO3- en N2 o NH4+. Las barras de error representan el error estándar propagado. Las incubaciones de sedimentos acondicionados se realizaron en octubre de 2018.

Diferentes factores parecen haber impulsado los cambios en la proporción en las diferentes condiciones, por ejemplo, en la condición Nitrate Replete, las tasas de desnitrificación fueron mucho más altas que las medidas normalmente en los sedimentos recién recolectados, mientras que las tasas de DNRA mostraron pocos cambios. Esto sugiere que las condiciones constantemente anóxicas y repletas de nitratos permiten que la comunidad de desnitrificación prospere en arenas permeables. Más interesante aún, las contribuciones relativas de DNRA y la desnitrificación variaron consistentemente con respecto a las tasas de reducción de sulfato en las incubaciones (Fig. 5A, B), con la proporción de DNRA positiva y fuertemente correlacionada con mayores tasas de reducción de sulfato (Fig. 5C). Esto sugiere que la reducción de sulfato podría ejercer una influencia importante en la respiración de N cuando los procesos ocurren simultáneamente.

A La tasa de DNRA frente a la tasa de reducción de sulfato en ausencia de nitrato. B La tasa de desnitrificación (formación de 15N-N2) frente a la tasa de reducción de sulfato en ausencia de nitrato. Las barras verticales representan el error estándar y las barras horizontales son los errores estándar propagados de las tasas de reducción de sulfato. C La tasa de producción de 15NH4+ (DNRA) como porcentaje de la producción total de N reducido (es decir, 15N-N2 + 15NH4+) frente a la tasa de reducción de sulfato (SRR) que se determinó en incubaciones paralelas en ausencia de nitrato. Las barras horizontales representan el error estándar, mientras que las barras verticales representan el error estándar propagado. Estas incubaciones se realizaron en octubre de 2018.

La correlación entre la desnitrificación y la proporción de DNRA y la reducción de sulfato fue impulsada en gran medida por aumentos en la tasa de DNRA (Fig. 5), en lugar de disminuciones en la tasa de desnitrificación (Fig. 5C), la última de las cuales fue similar en la variable y el nitrato. condiciones de agotamiento (Fig. 4B). De hecho, las tasas de DNRA en la condición de agotamiento de nitrato fueron más del doble de las medidas en el sedimento recién recolectado, lo que sugiere que las condiciones constantemente anóxicas de agotamiento de nitrato apoyaron a los microorganismos capaces de cambiar rápidamente a DNRA al agregar nitrato. Además, la disminución en la tasa de reducción de sulfato que observamos al agregar nitrato también se correlacionó fuertemente con la tasa de DNRA (Fig. 6 complementaria). Estos resultados sugieren que el DNRA podría estar relacionado con la reoxidación de los compuestos reducidos formados durante la reducción del sulfato (es decir, Fe o H2S) o, alternativamente, que una parte de la comunidad reductora del sulfato puede haber cambiado a DNRA en presencia de nitrato. Sin embargo, la reoxidación completa de sulfuro a sulfato es notoriamente difícil de cuantificar experimentalmente en sedimentos marinos [62], por lo que cambiamos a un enfoque ómico para obtener información sobre los posibles vínculos entre DNRA y el ciclo de azufre dentro de estos sedimentos.

Examinamos las afiliaciones filogenéticas de las transcripciones de nrfA (el gen marcador clave para DNRA) en tres capas de sedimentos en el sitio de muestreo (0–1 cm, 2–4 cm y 7–10 cm). En promedio, el 90% de las transcripciones de nrfA identificadas podrían asignarse taxonómicamente al nivel de clase (Fig. 6). Las asignaciones de transcripciones fueron similares en todas las capas de sedimentos, aunque los niveles relativos de transcripción de nrfA fueron más altos en las dos capas de sedimentos más profundas (Fig. 7 complementaria). Alrededor de la mitad de las transcripciones se asignaron a órdenes dentro del filo Desulfobacterota (recientemente reclasificado de Deltaproteobacteria; ver ref. [63]) que están asociados con la reducción de sulfato; principalmente Desulfobacterales, seguido de Desulfuromonadales y Desulfovibrionales (Fig. 6B). En contraste, hubo muy pocas transcripciones de nrfA asignadas a clases que contienen oxidantes de sulfuro, como Chromatiales y Woeseiaceae, que son comunes en estos sedimentos [64, 65]. La mayoría de las otras transcripciones de nrfA se asignaron taxonómicamente a una clase que rara vez se asocia con el metabolismo disimilatorio del azufre; los Bacteroidetes y específicamente, las familias Bacteroidia y Flavobacteriia (Fig. 7 complementaria y Tablas complementarias 4, 5), que generalmente son anaerobios facultativos y fermentadores.

Una asignación de transcripciones nrfA a phylum (negrita) o nivel de orden. Los colores indican el potencial de estas clases para llevar a cabo el metabolismo del azufre según lo identificado a partir de encuestas bibliográficas. La abundancia de transcritos se normalizó por la longitud del gen y contra la abundancia total de rpoB en el metatranscriptoma. B Asignación de transcritos de Desulfobacterota nrfA a nivel de orden, como porcentaje del total de transcritos de nrfA asignados a Desulfobacterota. En ambos paneles, se muestran los promedios de tres metatranscriptomas individuales y las barras de error son la desviación estándar. Estas muestras fueron secuenciadas en 2015.

Por lo tanto, la transcripción de nrfA sugiere que el DNRA en el sedimento se lleva a cabo en gran medida por anaerobios/fermentadores facultativos y organismos que se consideran clásicamente reductores de sulfato. En conjunto, nuestros resultados indican que la correlación entre la reducción de sulfato y DNRA en el sedimento está impulsada por microorganismos reductores de sulfato que cambian entre reducción de sulfato y DNRA. Esta observación muestra que el ciclo del nitrógeno y el azufre en los sedimentos puede estar vinculado por la actividad directa de las bacterias que cambian los aceptores de electrones, en lugar de, como se suele suponer, la oxidación del sulfuro junto con la reducción de NO3.

También se ha sugerido que la acumulación de sulfuro durante el ciclo S afecta el ciclo N a través de la inhibición de la óxido nitroso reductasa, lo que reduce la producción de N2 y aumenta la producción de N2O [44, 66]. Por el contrario, solo hubo una correlación negativa débil entre la tasa de reducción de sulfato y las tasas de producción de N2 en este estudio, y la correlación se debió principalmente a la tasa de desnitrificación muy alta en la condición de reposición de nitrato (Fig. 6). Los cambios en la tasa de producción de N2 no fueron compensados ​​por grandes aumentos en la producción de N2O, que representó solo un pequeño porcentaje de la producción total de N gaseoso (es decir, N2O + N2) (Tabla complementaria 6). La producción neta de N2O ocurrió en todos los sedimentos en las primeras horas de las incubaciones, seguida por el consumo neto a medida que el nitrato se volvió limitante, como se observa típicamente en estos sedimentos (Fig. 7, Figs. Complementarias 3, 4, 8, 9). Curiosamente, la producción neta de N2O al comienzo de las incubaciones fue similar, independientemente de la tasa de desnitrificación general. Esto condujo a un aumento sustancial en la relación de producción de N2O:N2 al comienzo de las incubaciones en las que las tasas de desnitrificación eran bajas y las tasas de reducción de DNRA y sulfato eran altas. Además, hubo una reducción neta más lenta de N2O cuando el NO3- se volvió limitante en estas incubaciones. Es posible que la producción de sulfuro inhibiera parcialmente la N2O reductasa (aunque cabe señalar que esto no habría sido un factor importante en la relación desnitrificación:DNRA). Alternativamente, la producción de Fe(II) en las incubaciones con mayores tasas de reducción de sulfato podría haber llevado a una mayor producción de N2O por reacciones abióticas [67]. Independientemente del mecanismo, nuestros resultados sugieren que la liberación del gas de efecto invernadero N2O no se reduciría con un cambio de desnitrificación a DNRA, a pesar de que el DNRA en sí mismo no libera N2O.

La producción de N2 (círculos negros) y N2O (círculos abiertos, valores multiplicados por 10) en el núcleo Nitrate Replete (A) y el Nitrate Deplete core (B) durante todo el tiempo de incubación en nmol 15N cm−3 de sedimento. Las líneas conectan el valor promedio en cada punto de tiempo. Cada punto representa una medición de una incubación separada. Estas incubaciones se realizaron en octubre de 2018.

Aquí mostramos que en sedimentos costeros permeables, la reducción de sulfato ocurre en sedimentos repletos de nitrato, donde se superpone con los procesos de desnitrificación y DNRA, aumentando así el volumen de sedimento en el que puede ocurrir la reducción de sulfato. Sin embargo, las tasas de reducción de sulfato medidas en sedimentos superficiales recién recolectados fueron aproximadamente del 10 al 20% de la tasa de reducción de N. Esto implica que, si bien los reductores de sulfato parecen ser tolerantes al nitrato en el sedimento, solo contribuyen a una proporción menor de la renovación total de carbono en la capa superficial (0–2 cm), como se ha observado en otros sedimentos intermareales permeables [8]. .

Además, encontramos que una proporción sustancial de DNRA en el sedimento parece ser realizada por organismos considerados reductores de sulfato clásicos. La capacidad de estos microorganismos para respirar e incluso crecer a través de la reducción de nitratos se ha reconocido durante mucho tiempo y, curiosamente, también se ha asociado con una alta tolerancia a la exposición al oxígeno [48, 49, 68]. Sin embargo, rara vez se ha observado la reducción de nitrato como estrategia de respiración por parte de los reductores de sulfato en sedimentos marinos; probablemente porque generalmente se considera que la reducción de sulfato ocurre solo en ambientes anóxicos, estables y sin nitrato. En contraste, los organismos que normalmente se clasificarían como reductores de sulfato parecen ser miembros clave de la comunidad microbiana en sedimentos permeables donde hay fluctuaciones rápidas entre condiciones totalmente óxicas y repletas de nitrato y condiciones anóxicas y de agotamiento de nitrato (Fig. 8). Como consecuencia, la reducción de sulfato y nitrato no solo ocurre simultáneamente en el sedimento, sino que está directamente vinculada dentro de la Desulforbacterota. Esto implica que el tamaño y la actividad de la comunidad reductora de sulfato controla el potencial de DNRA dentro de estos sedimentos (Fig. 8). Esto también podría explicar la actividad mejorada de DNRA y el aumento de los flujos de amonio a la columna de agua que se han observado en los sedimentos subyacentes a las columnas de agua hipóxica [69]. Esto contrasta con la opinión común de que la relación entre el donante de electrones y el nitrato/nitrito es el principal factor que impulsa el equilibrio entre el DNRA y la desnitrificación [70,71,72]. Dado que el DNRA retiene el nitrógeno fijo dentro de los ecosistemas como amonio, en lugar de eliminarlo como la desnitrificación, nuestros resultados indican que la presencia de comunidades reductoras de sulfato activas puede influir en la eutrofización.

Esquema que describe los cambios en la actividad microbiana durante un ciclo de marea (paneles izquierdo y central) y en un caso en el que las bacterias reductoras de sulfato se vuelven más abundantes (panel derecho). Cuando la marea está baja, solo la superficie superior del sedimento tiene nitrato y la reducción de nitrógeno está dominada por la desnitrificación. Cuando sube la marea, el nitrato penetra más profundamente en la superficie y, en consecuencia, a más reductores de sulfato, que cambian su metabolismo a DNRA. Esto da como resultado una relación desnitrificación:DNRA más uniforme. En sedimentos con más reductores de sulfato, se espera que las tasas de DNRA también aumenten ya que algunos reductores de sulfato realizan DNRA. Por simplicidad, se desprecia la dinámica del oxígeno.

Se recolectaron sedimentos de la planicie de arena de Janssand, un área intermareal arenosa que se encuentra en la región de la barrera trasera de la isla de Spiekeroog, en el Mar de Wadden, en el noroeste de Alemania, es decir, entre la isla y el continente. Las descripciones detalladas del sitio están disponibles en [6 , 56, 73]. La planicie tiene un ciclo de mareas semidiurno, por lo que se inunda con agua durante 5 a 6 horas durante la marea alta y queda expuesta durante 6 a 7 horas durante la marea baja [6, 73]. El plano superior tiene un tamaño medio de grano de 176 µm, una porosidad de 0,35 y una permeabilidad de aproximadamente 7,2 * 10−12 m2 [6, 56]. Cuando el banco de arena se inunda con agua de mar, la interacción de las corrientes de agua del fondo con la topografía ondulada del sedimento conduce a una advección variable del agua de mar hacia el sedimento y las profundidades de penetración de O2 varían entre 1 y 5 cm [7, 10, 53]. Durante la marea baja, el O2 y el NO3 dentro del agua intersticial se agotan rápidamente y las profundidades de penetración del O2 caen a <1 cm [10, 54].

Se usaron revestimientos de núcleo de PVC (DI 3,5 cm) para recolectar tres núcleos verticales del plano de arena superior de Janssand durante la marea baja en dos ocasiones (17 de octubre de 2018 y 22 de mayo de 2019) y se transportaron al laboratorio (~ 2 h). En octubre la temperatura del agua superficial fue de aproximadamente 14 °C y en mayo de 11 °C.

Los núcleos se transfirieron a una cámara anaeróbica y la capa pálida superior (oxidada) (0–3 cm) se separó de una capa oscura (reducida) (7–10 cm) (Fig. 1 complementaria). La capa superior se mezcló bien antes de transferir alícuotas de sedimento de 2 cm3 a viales de vidrio de 12 ml con septos (LabCo, Manchester), en lo sucesivo denominados "Exetainers", que se llenaron con agua de mar anóxica filtrada recolectada el 10 de octubre de 2018 (NO3- + NO2-- < 2 µM) creando lodos de sedimentos. Los exetainers se taparon sin espacio de cabeza y se retiraron de la cámara anaeróbica, después de lo cual se asignaron a uno de los tres grupos de tratamiento (Fig. 1 complementaria). 38 Exetainers por núcleo recibieron 60 µM de NO3 marcado con 15N (correspondiente a ~300 nmol/cm3 de sedimento), 24 recibieron 60 µM de NO3 marcado con 15N y 250 kBq de sulfato marcado con 35S, 24 recibieron solo 250 kBq de 35S marcado sulfato. Los Exetainers rellenos se colocaron en tanques de rodillos sobre una mesa de rodillos. La velocidad de la mesa de rodillos se fijó para invertir suavemente los Exetainers cada 44 segundos a lo largo de su eje longitudinal para garantizar que las lechadas permanecieran homogéneas. Las observaciones visuales confirmaron que esto mezclaba constantemente el sedimento con el agua de mar en los viales.

Los lodos se pesaron y mataron por duplicado en 12 puntos de tiempo seleccionados con el objetivo de incluir puntos de tiempo antes y después del agotamiento de NO3. Los lodos sin 35S añadido (es decir, aquellos con sólo 15N) se mataron inyectando 100 µL de cloruro de zinc al 30 % p/v y 200 µL de cloruro de mercurio saturado para que fueran adecuados para análisis posteriores de gas 15N. Las lechadas con 35S añadido se mataron extrayendo primero 1,8 ml de agua de muestra que se pipeteó directamente en 200 µl de acetato de zinc al 20 % p/v (muestras de radioactividad total) y se almacenó a 4 °C, y el sedimento y el agua restantes se decantaron directamente en 50 Tubos falcon de ml precargados con 7 ml de acetato de zinc al 30 % (muestras TRIS) y congelados a -20 °C.

Se recogieron sedimentos de los 2 cm superiores de la arena y aproximadamente 70 L de agua de mar superficial (~13 °C, NO2- + NO3-- < 2 µM) el 10 de octubre de 2018 durante la marea baja y se transportaron al laboratorio (~2 h). El agua de mar se filtró (filtros de polietersulfona, tamaño de poro de 0,2 µm) y se almacenó en la oscuridad a 4 °C para su uso en núcleos de flujo continuo e incubaciones.

La arena de la superficie se homogeneizó y se rellenó en cuatro núcleos acrílicos cilíndricos con un diámetro interior de 9 cm siguiendo [5]. Las arboledas radiales que rodean un puerto central en la base de los núcleos se protegieron con una malla de nailon de 500 µm (Hydra-BIOS, Alemania) para facilitar el flujo pistón. Los núcleos se llenaron suavemente con arena hasta 23–27 cm mientras se sumergían en agua de mar recién recolectada para evitar atrapar burbujas de aire. Los núcleos llenos se taparon y luego se conectaron a una bomba peristáltica en la base mediante una tubería de vitón (Fig. 1 complementaria).

Los núcleos se asignaron a 1 de 4 condiciones (Tabla 1) y el agua de mar filtrada previamente desoxigenada burbujeando con N2 (y posteriormente mantenida bajo un espacio libre de N2) se bombeó al fondo del núcleo de acuerdo con los cuatro regímenes de acondicionamiento durante cinco días. El núcleo destinado a imitar el sedimento superficial, la condición Repleto de nitratos, recibió un suministro constante de agua rica en NO3, mientras que el núcleo destinado a imitar los sedimentos profundos, la condición Repleto de nitratos recibió un suministro constante de agua de mar pobre en NO3 (Fig. 1). Dos núcleos adicionales estaban destinados a imitar porciones de sedimento con disponibilidad variable de NO3. En la primera, la condición Variable Redox / Eliminación de Producto, el flujo de agua fue constante, trayendo agua rica en NO3 durante 6 h seguida de agua pobre en NO3 durante 6 h. En el segundo, la condición Variable Redox / Acumulación de Producto, se proporcionó agua rica en NO3 durante 6 hy luego se dejó que el agua se estancara en el núcleo durante 6 h. Se suministró agua de mar para los núcleos modificados con NO3 con 200 µM de NO3 durante los primeros dos días y luego con 400 µM para garantizar la disponibilidad de NO3 en toda la zona de prueba (4 a 10 cm desde la entrada; consulte la Tabla complementaria 7). El agua de mar se suministró a una velocidad de ~50 ml por hora durante el bombeo y, por lo tanto, tuvo un tiempo de residencia de ~11 h en los núcleos con un flujo de agua constante (condiciones de reposición de nitrato, agotamiento de nitrato y redox variable/eliminación de producto). La influencia y disponibilidad de O2 fue mínima, ya que el agua de entrada había sido desgasificada por el burbujeo de N2. El sulfuro y el Fe II se determinaron usando azul de metileno [74, 75].

Después de 5 días de preacondicionamiento, se determinaron las tasas de reducción de NO3 y sulfato para el sedimento de cada núcleo. Cada núcleo se colocó en una cámara anaeróbica bajo una atmósfera de N2 y se tomaron muestras de sedimento de 4 a 10 cm por encima de la base del núcleo y se homogeneizaron. A continuación, el sedimento se transfirió a Exetainers (Labco, Manchester) para crear lodos, después de lo cual se efectuó el marcaje con 15N-NO3-, 35S-sulfato y el muestreo posterior de forma idéntica a las incubaciones de sedimento fresco. Las muestras marcadas con 35S-sulfato de T0-T2 en las condiciones Nitrate Replete y Nitrate Deplete, y T0 en los sedimentos acondicionados de forma variable no se pesaron antes de decantarlas en acetato de zinc, por lo tanto, se utilizó la masa de sedimento promedio de otras muestras en sus respectivos tratamientos. para el cálculo de tarifas.

Las tasas de reducción de sulfato se determinaron de acuerdo con Roy et al. [76]. Brevemente, las muestras de 35S conservadas con zinc se trataron con una destilación de ácido de cromo en frío para extraer el contenido total de azufre inorgánico reducido (TRIS) que contenía 35S. Se determinó la radiactividad 35S total en el sobrenadante y la radiactividad TRIS 35S para cada extainer individual en un contador de centelleo líquido (Tri-Carb 4910 TR Liquid Scintillation Analyzer, Perkin Elmer) utilizando líquido de centelleo Ultima-Gold (Perkin-Elmer). La cantidad total de sulfato reducido por muestra se calculó con la ecuación. (1) adaptado de [76]. Las tasas se determinaron trazando el sulfato total reducido con el tiempo y aplicando ajustes lineales. En las incubaciones de sedimento fresco de octubre, se inyectó una cantidad inconsistente de trazador en los exetainers, por lo que solo se incluyeron aquellos exetainers que contenían más de 20 kBq de 35S en la medición.

Las concentraciones de sulfato \(\left( {\left[ {SO_4^{2 - }} \right]} \right)\) en las incubaciones con extainer se determinaron mediante cromatografía iónica (Metrohm 9300 Compact IC Flex con captura de zinc en línea). columna), y el valor promedio (calculado sin valores atípicos del error de dilución) para cada serie de tiempo se utilizó para los cálculos de tasas posteriores.

Se creó un espacio de cabeza de helio de 2 ml en Exetainers (Labco, Manchester) al que se había añadido 15N. El líquido que se eliminó durante este procedimiento se usó luego para la medición de NOx y 15NH4+.

La concentración de NOx del agua se determinó fotométricamente (Infinite M200 Pro, Tecan) usando una versión de la reacción de Griess modificada para determinar secuencialmente NO3- y NO2- a bajas concentraciones en pequeños volúmenes [77, 78].

Las concentraciones de 15N-N2 se midieron con un GC-IRMS (Isoprime PreciSION, Elementar). En total, se inyectaron 100 µl de gas submuestreado del espacio de cabeza de los Exetainers directamente en el GC-IRMS para determinar la abundancia relativa de 29 y 30 N2. A continuación, se utilizó una curva estándar de inyecciones de aire ambiente para calcular las concentraciones de gas según [79]. Los valores se corrigieron para el gas disuelto en el agua eliminada durante la separación de cabeza. La suma de la producción de 15N-N2 en cada punto de tiempo se calculó como (29N2 + (2 * 30N2)).

Después de la medición de 15N-N2, los Exetainers se enriquecieron con 60 µL de N2O y se dejaron equilibrar durante la noche. Las muestras se midieron como antes, pero inyectando 250 µL de gas, detectando 45N2O y 46N2O, y con una curva estándar de N2O. Los valores se corrigieron para la solubilidad de N2O y para el gas disuelto en agua eliminado durante la separación de cabeza. En octubre, el N2O solo se midió en dos exetainers por punto de tiempo, mientras que en mayo se midieron tres exetainers por punto de tiempo.

La producción de 15N-amonio se determinó después de la oxidación a N2 según [80, 81]. A continuación, se midió el 15N-N2 en el espacio de cabeza como anteriormente. Los estándares de 15N-NH4+ se convirtieron al mismo tiempo para garantizar que la eficiencia de conversión fuera siempre > 95 %.

Se realizó una regresión lineal en los datos para calcular las tasas (Tabla complementaria 1-3).

La metatranscriptómica se realizó en nueve muestras recolectadas en julio de 2015 descritas anteriormente en la ref. [38]. Brevemente, se tomaron muestras de sedimentos durante la marea baja tardía del llano de arena de Janssand utilizando tres núcleos de sedimentos. Los núcleos se cortaron inmediatamente en 3 capas (0–1 cm, 2–4 cm y 6–8 cm) según el color del sedimento (marrón, marrón a gris y gris a negro), que es representativo del sedimento superior oxidado/libre de sulfuro. zona, la zona de transición de sulfuro y la zona de sulfuro reducido. El sedimento se transfirió a tubos de 50 ml en 20 s y se almacenó inmediatamente en hielo seco oa -80 C hasta su posterior procesamiento. El ARN total se extrajo después del tratamiento con ADN-ase, la purificación y el agotamiento del ARNr bacteriano antes de la construcción de bibliotecas de ARN TrueSEQ. Estos se secuenciaron en pares en una plataforma Illumina HiSeq (consulte la ref. [38] para obtener más detalles).

Las transcripciones de nrfA y rpoB se identificaron en los metatranscriptomas utilizando el enfoque ROCker detallado en Marchant et al. (2018). Los modelos ROCker se construyeron según la ref. [82] usando una colección de secuencias de proteínas seleccionadas y, en el caso de nrfA, secuencias de proteínas de grupos externos estrechamente relacionadas (descargadas de http://enve-omics.ce.gatech.edu/rocker/models). Para la comparación entre metatranscriptomas, los números de lectura de transcritos de nrfA se normalizaron frente a los números de lectura de transcritos de rpoB y el tamaño correspondiente de cada gen antes de calcular un promedio para cada una de las tres capas de sedimento replicadas. La identidad taxonómica de las transcripciones se infirió utilizando Kaiju [83] (base de datos Genbank nr_euk descargada el 4 de agosto de 2020) y las muestras se agruparon al menos a nivel de clase cuando fue posible. A continuación, se asignó la capacidad de los organismos contenidos dentro de cada clase para utilizar compuestos S como donante o aceptor de electrones basándose en búsquedas bibliográficas (véanse en particular las referencias [84] y [85]). Para Deltaproteobacteria y Bacteroidetes (que fueron las clases a las que se asignaron la mayoría de las transcripciones de nrfA), la taxonomía se infirió a nivel de familia, antes de que se asignara la capacidad de utilización de S.

Los nueve metatranscriptomas descritos en el manuscrito disponible en NCBI bajo BioProject ID PRJNA924993.

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Nos gustaría agradecer a Kirsten Imhoff y Swantje Lillienthal por su asistencia con las mediciones de reducción de sulfato y a Gabi Klockgether por su asistencia con las mediciones de IRMS.

Esta investigación fue financiada por la Sociedad Max Planck y HKM fue financiada por el Clúster de Excelencia DFG "The Ocean Floor - Earth's Uncharted Interface" en MARUM, Universidad de Bremen (EXC-2077). Financiamiento de acceso abierto habilitado y organizado por Projekt DEAL.

Instituto Max Planck de Microbiología Marina, Celsiusstraße 1, 28359, Bremen, Alemania

OM Bourceau, T Ferdelman, G Lavik, MMM Kuypers y HK Marchant

Universidad de Viena, Departamento de Microbiología y Ciencias de los Ecosistemas, División de Ecología Microbiana, Djerassiplatz 1, A-1030, Viena, Austria

M. Mussmann

Universidad de Bremen, Centro de Ciencias Ambientales Marinas, MARUM, 28359, Bremen, Alemania

Marchante HK

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OMB y HKM diseñaron investigaciones, llevaron a cabo experimentos y analizaron datos. TF ayudó con el diseño de las mediciones y análisis de reducción de sulfato. MM proporcionó datos de metatranscriptómica. OMB, HKM, TF, MM, GL y MMMK escribieron el manuscrito.

Correspondencia a HK Marchant.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Reimpresiones y permisos

Bourceau, OM, Ferdelman, T., Lavik, G. et al. Reducción simultánea de sulfatos y nitratos en sedimentos costeros. ISME COMÚN. 3, 17 (2023). https://doi.org/10.1038/s43705-023-00222-y

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Recibido: 11 noviembre 2022

Revisado: 30 de enero de 2023

Aceptado: 09 febrero 2023

Publicado: 08 marzo 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s43705-023-00222-y

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