Los estímulos inflamatorios inducen la eliminación de sulfato de heparán de las células endoteliales porcinas arteriales pero no de las venosas, lo que conduce a respuestas proinflamatorias y procoagulantes diferenciales

Aug 25, 2023

Scientific Reports volumen 13, Número de artículo: 4483 (2023) Citar este artículo

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La disfunción endotelial es un evento temprano de lesión vascular definida por un fenotipo de células endoteliales (EC) proinflamatorias y procoagulantes. Aunque la interrupción del glucocáliz endotelial se asocia con daño vascular, se desconoce cómo diversos estímulos inflamatorios afectan al glucocáliz y si las células arteriales y venosas responden de manera diferente. Usando un sistema de microfluidos de canal redondo 3D, investigamos el glucocáliz endotelial, particularmente el sulfato de heparán (HS), en EC arteriales y venosas porcinas. La expresión de sulfato de heparán (HS)/glucocáliz ya se observó en condiciones estáticas en EC venosas mientras que dependía del flujo en células arteriales. Además, el análisis de la respuesta de HS/glucocáliz después de la estimulación con señales inflamatorias reveló que las CE venosas, pero no las arteriales, son resistentes a la eliminación de HS. Este hallazgo se observó también en vasos porcinos aislados. La persistencia de HS en las CE venosas impidió el depósito de complemento y la formación de coágulos después de la estimulación con factor de necrosis tumoral α o lipopolisacárido, mientras que después de la activación xenogénica no se observó protección mediada por el glucocáliz. Por el contrario, el desprendimiento de HS en las células arteriales, incluso sin un insulto inflamatorio, fue suficiente para inducir un fenotipo proinflamatorio y procoagulante. Nuestros datos indican que la respuesta dimórfica de las CE arteriales y venosas se debe en parte a las distintas dinámicas de HS/glucocáliz, lo que sugiere que los trastornos tromboinflamatorios arteriales y venosos requieren terapias dirigidas.

Las células endoteliales (EC) comprenden el revestimiento interno de los vasos sanguíneos y son cruciales para regular la homeostasis vascular, así como para mantener un fenotipo de vaso antiinflamatorio y anticoagulante1. En los trastornos vasculares esta homeostasis se altera debido a la disfunción endotelial2,3 que conduce a la pérdida de la integridad vascular y aumento de la permeabilidad4, reducción de la liberación de agentes vasoactivos como el óxido nítrico (NO)5, así como cambios en la trombogenicidad6 y en la expresión de la superficie moléculas de adhesión que influyen en las interacciones leucocitarias7,8. La disfunción endotelial está fuertemente asociada con el desprendimiento del glucocáliz endotelial, una capa protectora de proteínas y azúcares que cubre la superficie luminal de ECs9. Los principales componentes del glucocáliz endotelial son los proteoglucanos, como los sindecanos, ricos en cadenas laterales de glucosaminoglucanos, como el heparán sulfato (HS)10. Muchas proteínas plasmáticas reguladoras, como la antitrombina III (ATIII), el inhibidor de C1 o el factor H, tienen dominios de unión a HS11,12,13 a través de los cuales interactúan con el glucocáliz. La unión del factor H de la proteína reguladora del complemento a las superficies celulares a través de glucosaminoglucanos es crucial para proteger contra la activación excesiva del complemento14. Por otro lado, la unión de la ATIII al glucocáliz endotelial potencia su actividad inhibidora frente a la proteína de coagulación Factor XIa, bloqueando así la activación de la cascada de la coagulación15. Además, se ha sugerido que el glucocáliz forma un escudo no adherente en la superficie de las EC que inhibe la adhesión excesiva de leucocitos, lo que reduce la transmigración de leucocitos y la inflamación tisular16. Por lo tanto, el glucocáliz endotelial, en particular el HS, juega un papel crucial en la regulación de la homeostasis vascular al mantener un entorno antiinflamatorio y anticoagulante. La pérdida del glucocáliz endotelial se ha descrito en muchos trastornos17. Por ejemplo, la disfunción endotelial concurrente con factores de riesgo cardiovascular como la hipertensión, la diabetes y la obesidad, está directamente relacionada con la pérdida del glucocáliz endotelial de la superficie celular, el aumento de los eventos trombóticos y la progresión de la enfermedad18.

El desprendimiento de glicocalix también ocurre durante el trasplante, donde se asocia con una supervivencia deficiente del injerto y rechazo del tejido19. Esto se debe en parte a los altos niveles de la citocina proinflamatoria TNFα20,21 que regula al alza las enzimas proteolíticas, como la heparanasa y la metaloproteinasa de matriz 9 (MMP9), que escinden los proteoglicanos y el HS de la superficie celular, lo que provoca una alteración de la integridad vascular y rechazo vascular22,23. Recientemente, debido a la falta de donantes de órganos humanos, la investigación ha centrado su atención en el xenotrasplante, el trasplante de tejidos u órganos entre dos especies diferentes. Los cerdos se consideran actualmente el donante de órganos más prometedor. En el xenotrasplante, los anticuerpos preformados del receptor, dirigidos a los residuos de azúcar en la superficie de las CE porcinas del donante, inducen el desprendimiento del glucocáliz, el depósito del complemento y la disfunción endotelial, lo que finalmente culmina en el rechazo del órgano24,25,26.

Aparte del xenotrasplante, otra condición inflamatoria en la que el desprendimiento del glucocáliz endotelial se considera un sello distintivo de la enfermedad es la sepsis. Allí, la cantidad de componentes del glucocáliz que se desprenden de las EC y se miden en el plasma se correlacionan con el desarrollo de la coagulación intravascular diseminada27 y la reducción de la supervivencia del paciente28.

Aunque se ha demostrado que las condiciones inflamatorias dañan el glucocáliz e inician o propagan la enfermedad, se desconoce si el glucocáliz en las CE de varios lechos vasculares responde de manera diferente a los insultos inflamatorios y si esto tiene un impacto en el comportamiento de las CE. Se han descrito diferencias fisiopatológicas en el estado de hipercoagulabilidad de las células arteriales y venosas29. Las CE de la vena cava inferior en comparación con las CE aórticas regulan fuertemente la expresión de moléculas de adhesión en respuesta a la citocina proinflamatoria TNFα30. Aún se desconoce si esta heterogeneidad entre las CE se debe a diferencias en el patrón de glucocáliz en la superficie celular y si esto conduce a una disfunción endotelial más fuerte en las venas en comparación con la aorta. Presumimos que las diferencias en la dinámica del glucocáliz influyen en la interacción del endotelio con las proteínas reguladoras que conducen a distintas respuestas en diferentes lechos vasculares.

Para determinar si la dinámica del glucocáliz es diferente para las células arteriales y venosas, comparamos el patrón de expresión del glucocáliz en CE arteriales y venosas porcinas primarias utilizando un sistema de microfluidos 3D de canal redondo. Nos centramos en analizar el papel de HS, el actor principal en el mantenimiento de las funciones fisiológicas del glucocáliz11, en condiciones estáticas o de flujo, y tras la estimulación con varios estímulos inflamatorios como el suero humano, para imitar un entorno de xenotrasplante, TNFα y LPS. La interacción entre el glucocáliz y la disfunción endotelial se analizó evaluando la activación del complemento, la adhesión de leucocitos y la activación de la cascada de la coagulación.

Las CE macrovasculares primarias se aislaron de la aorta torácica y la vena cava porcina obtenidas de cerdos de razas locales hembras y machos de 4 a 8 meses de edad después de la eutanasia. De acuerdo con los principios de las 3R, los recipientes se obtuvieron de animales utilizados para experimentos terminales por otros grupos de investigación de la Universidad de Berna. A estos animales se les proporcionó anestesia general a través de propofol (1-4 mg/kg) y ketamina (1 mg/kg), mantenida con propofol (2-8 mg/kg/h) y fentanilo (5-30 g/kg/h). ) y se proporcionó analgesia adicional con ropivacaína (0,5%) y morfina (0,1 mg/kg). La muerte del animal se definió como la extracción del corazón del cuerpo o cuando la señal del EEG permaneció plana durante al menos 60 s después de la administración de rocuronio y la interrupción de la ventilación mecánica. Los experimentos con animales y la eutanasia se realizaron de acuerdo con las regulaciones federales suizas y fueron aprobados por la oficina veterinaria cantonal, Berna, Suiza. Las EC arteriales se recogieron mecánicamente de la luz de la aorta con un hisopo de algodón humedecido, mientras que las EC venosas se recolectaron de la vena cava mediante digestión enzimática con colagenasa II (Worthington LS004174, 1,88 U/ml en DMEM puro). Las células se cultivaron en medio completo (DMEM Glutamax, Gibco 21885-025) con un 10 % de suero fetal bovino inactivado por calor (FBS, Sigma F7542) y un 1 % de penicilina/estreptomicina (P/S, Gibco 15140-122) suplementado con un 1 % de suero endotelial mezcla de suplemento de medio de crecimiento 2 (PromoCell C-39216) y monitoreada diariamente para evitar el crecimiento excesivo de fibroblastos. Tras la confluencia, las células se fenotiparon, crioconservaron y almacenaron para futuros experimentos. Las células se fenotiparon mediante tinción para marcadores EC CD31 y factor de von Willebrand, así como actina de músculo liso α para comprobar la pureza. Solo se usaron cultivos que expresaban ambos marcadores EC y menos del 10% de actina de músculo liso α. Las células se usaron exclusivamente hasta el pase cuatro para evitar la deriva fenotípica. Para todos los experimentos, se utilizaron EC de al menos 2 donantes de cerdo diferentes.

Las células mononucleares de sangre periférica (PBMC) se aislaron recientemente de sangre entera anticoagulada con EDTA humana o porcina mediante centrifugación de densidad. Se obtuvieron muestras de sangre humana de voluntarios sanos con consentimiento informado y se anonimizaron inmediatamente después de la donación. El protocolo de estudio fue aprobado por el comité de ética local del Cantón de Berna y los experimentos se realizaron de acuerdo con las normas federales suizas y las directrices de la Universidad de Berna. Para el aislamiento de PBMC, primero se centrifugó la sangre para eliminar el plasma, que luego se reemplazó con cantidades iguales de PBS-2%FBS. La sangre diluida se colocó en capas sobre medio de centrifugación en gradiente de densidad Ficoll-Paque (Cytivia 17144002) y las PBMC se aislaron de acuerdo con el protocolo del fabricante. Posteriormente, las PBMC se lavaron con PBS-FBS al 2 %. Las PBMC humanas se utilizaron recién después del aislamiento, mientras que las PBMC porcinas se congelaron en FBS con DMSO al 10 % (sulfóxido de dimetilo, Sigma D4540-100ML) para su uso posterior.

Se prepararon chips microfluídicos de polidimetilsiloxano (PDMS) que contenían canales de sección redonda 3D con un diámetro de 550 μm como se describió anteriormente31. Los canales de microfluidos se recubrieron con 50 μg/ml de fibronectina (Merck FC010) y 100 μg/ml de colágeno II (Gibco A10644-01). A continuación, se sembraron EC arteriales y venosas (1 millón de células/ml) en medios de flujo (DMEM con 10 % de FBS, 1 % de P/S, 4 % de dextrano, Sigma 31390-100G y 1 % de albúmina de suero bovino, Sigma A7030-100G) y se dejó adherir durante la noche a 37 °C. Una vez confluentes, cada canal se conectó a una bomba peristáltica (Gilson minipuls 3). Utilizando tubos de silicona, el medio de flujo se extrajo de un depósito y se pasó a través de una trampa de burbujas antes de llegar a las celdas. La bomba peristáltica se ajustó para generar un esfuerzo cortante laminar de 2 dyn/cm2 o 12 dyn/cm2 (viscosidad del medio μ = 2,1 mPa·s) durante 72 h. Los chips de microfluidos se mantuvieron en una incubadora humidificada a 37 °C y con 5% de CO2. Los medios se cambiaron cada 24 h para suministrar nutrientes frescos.

Para los canales de microfluidos, las células se cultivaron durante 72 h bajo flujo o en condiciones estáticas y posteriormente se fijaron con formaldehído al 4 % (Sigma 252549-500ML solución madre al 37 %) durante 20 min a temperatura ambiente. Después de bloquear durante una hora a temperatura ambiente con PBS-BSA al 3 %, las células se incubaron durante la noche a 4 °C con anticuerpo anti-heparán sulfato (Amsbio 370-255-1, clon F58-10E4), lectina de aglutinina de germen de trigo (WGA) (Sigma L4895-2MG) para teñir N-acetilglucosamina (GlcNAc) y ácido siálico, anticuerpo anti-CD31 porcino (R&D MAB33871) y/o componente del complemento anti-humano policlonal C3b/c (DAKO A0062) diluido en PBS-1%BSA -0,05 % de interpolación (interpolación 20, AppliChem A4974,0250). Posteriormente, las muestras se incubaron durante 1,5 h con agitación a temperatura ambiente con anticuerpos secundarios: cabra anti ratón IgM AlexaFluor568 (Invitrogen A21043) o cabra anti ratón IgM AlexaFluor488 (Invitrogen A21042) para heparán sulfato, cabra anti rata IgG AlexaFluor633 (Invitrogen A21094) o cabra anti-rata IgG AlexaFluor568 (Invitrogen A11077) para CD31 y/o cabra anti-conejo IgG AlexaFluor633 (Invitrogen A21071) para C3b/c. Todos los anticuerpos secundarios se diluyeron en PBS-BSA al 1 %-Tween al 0,05 %. Se usó DAPI (Simga, 32670-20MG-F) para teñir los núcleos celulares. Luego, los chips de microfluidos se lavaron y se tomaron imágenes con un objetivo de 20 × en un microscopio confocal Zeiss LSM710 AxioObserver o Zeiss LSM980 y se analizaron con Image J (versión 2.3.0/1.53q). La tinción con GlcNAc/ácido siálico y HS se analizó cuantificando la cobertura según un método adaptado de Cheng et al.32. Para la cuantificación, el umbral de fluorescencia se ajustó para reducir el ruido de fondo y la imagen se convirtió en una máscara en blanco y negro. Se usó ImageJ para medir el porcentaje de áreas blancas en comparación con el área del canal y este porcentaje se comparó con la cobertura de glicocalix, que se normalizó al número de células por canal. Se analizaron al menos tres imágenes por muestra. Para los portaobjetos de cámara, utilizados para caracterizar las EC cultivadas, se empleó el mismo procedimiento descrito anteriormente. Luego, los portaobjetos se montaron con el reactivo antidesvanecimiento de oro ProLong (Invitrogen P36934) y se adquirieron con un microscopio fluorescente con un aumento de 20x (Leica DMI4000B).

Se prepararon vasos frontales a partir de aorta torácica y vena cava porcinas recién aisladas que se cortaron en piezas de 1 cm ^{2} y se fijaron con formaldehído al 4% durante 20 min a temperatura ambiente. A continuación, se bloquearon las piezas de los vasos y se tiñeron para determinar el factor de von Willebrand (DAKO A0082), CD31 y los componentes del glucocáliz como se ha descrito anteriormente. Las imágenes se adquirieron con un microscopio confocal (Zeiss AxioObserver LSM710).

Para obtener secciones de vasos, se incluyeron anillos de aorta torácica y vena cava porcinas recién aisladas en compuesto TissueTek OCT (Sakura 4583). Las secciones de 5 μm de espesor se fijaron con acetona fría al 100 % (AppliChem 141007.1211) y se incubaron durante 30 min con NHS al 20 % diluido en TBS para inducir el desprendimiento de HS y la deposición del complemento. Las secciones de control se incubaron solo con TBS. Las criosecciones se bloquearon con TBS-BSA al 3%, se tiñeron y se montaron como se describe anteriormente. Las imágenes se adquirieron con un microscopio confocal con un aumento de 20x (Zeiss LSM980). Para obtener imágenes del glucocáliz en células vivas no fijadas, los canales de microfluidos se perfundieron durante 72 h (2 dyn/cm2 o 12 dyn/cm2) y luego se tiñeron durante 30 min bajo flujo con WGA-Lectin y tinción nuclear de Hoechst usando las diluciones descritas anteriormente en flujo. medios sin FBS. Se tomaron imágenes de los canales inmediatamente utilizando un microscopio confocal con un aumento de 20x (Zeiss LSM980).

Después de 72 h de alto estrés de cizallamiento (12 dyn/cm2), las células se dejaron sin tratar o se incubaron bajo flujo con suero humano normal al 10 % (recolectado de voluntarios sanos) durante 2 h, factor de necrosis tumoral α humano recombinante 100 ng/ml (TNFα , R&D 210-TA), 100 μg/ml de lipopolisacárido (LPS, Sigma L4391) o 5 U/ml de heparinasa I + III (Sigma H3917-100UN) durante 4 h a 37 °C en medios de flujo sin suero. Para evaluar el depósito de complemento en células estimuladas con TNFα, LPS y heparinasa I + III, los canales se perfundieron adicionalmente con suero porcino al 10% durante las últimas 2 h de activación. Después de la fijación, las muestras se tiñeron usando un anticuerpo anti-complemento C3b/c como se describe anteriormente.

Las células se sembraron en canales de microfluidos de sección redonda 3D y se perfundieron durante 72 h en condiciones de estrés de cizallamiento de 12 dyn/cm2, después de lo cual se trataron con suero humano normal, TNFα humano recombinante, LPS o heparinasa I + III como se describió anteriormente. Los núcleos de EC dentro de los canales se tiñeron bajo flujo con tinción nuclear Hoechst 3342 (Tocris 23491-52-3). A continuación, las PBMC aisladas de humanos o porcinos se marcaron con CFSE (ThermoFisher C34554) según las instrucciones del fabricante y se resuspendieron en medio de flujo sin dextrano. Cada canal se perfundió a una tensión de cizallamiento de 0,2 dyn/cm2 con 1 millón/ml de PBMC marcadas mientras se adquirían imágenes cada 3 s durante 20 min. Se crearon archivos de video con una velocidad de cuadro de 3 cuadros por segundo para su análisis. La adhesión de PBMC se definió como el número de células inmovilizadas durante al menos 3 s (es decir, un marco). Las células se contaron manualmente para cada registro de lapso de tiempo. Los canales se fijaron después de la perfusión de PBMC y se tiñeron para HS como se describe anteriormente.

Las células se sembraron en canales de microfluidos de sección redonda 3D como se describió anteriormente y posteriormente se perfundieron a una tensión de cizallamiento de 12 dyn/cm2 con plasma de citrato humano recalcificado (de voluntarios anónimos sanos) o porcino (Merck P2891) enriquecido con 15 μg/ml AF488 marcado fibrinógeno humano (Thermofisher F13191). El plasma enriquecido con fibrinógeno se recalcificó mediante la adición de CaCl2 (Sigma 10043-52-4) 25 mM (plasma humano) o 13 mM (plasma porcino) inmediatamente antes de la obtención de imágenes. Durante la perfusión, se tomaron imágenes de las células cada 5 s durante un máximo de 15 min utilizando un microscopio confocal (Zeiss LSM980). El experimento finalizó cuando se produjo la oclusión completa del canal o cuando la oclusión del canal provocó un aumento de la presión dentro del sistema de microfluidos que condujo al desprendimiento completo de las células de la superficie del canal. El tiempo hasta la oclusión se determinó a partir de archivos de vídeo con una velocidad de fotogramas de 3 fotogramas por segundo.

Todos los conjuntos de datos se analizaron con el software GraphPad Prism 9 y se consideró significativo p < 0,05. Se realizó ANOVA unidireccional seguido de comparaciones múltiples utilizando la prueba t de Tukey por pares para conjuntos de datos con más de 2 grupos. Para el depósito del complemento, se realizó ANOVA bidireccional de coagulación y adhesión de PBCM, seguido de múltiples comparaciones usando análisis post-hoc de Tukey y Bonferroni. Los experimentos se realizaron con un mínimo de tres réplicas biológicas.

Para determinar cómo el estrés de cizallamiento afecta la expresión de diferentes componentes del glicocalix e investigar si el glicocalix podría explicar el comportamiento diverso de las EC arteriales y venosas durante los trastornos inflamatorios, analizamos la cobertura del glicocalix en la superficie de la EC mediante inmunofluorescencia. Las células venosas y arteriales se cultivaron durante 72 h en condiciones de estrés de cizallamiento estático o laminar (12 dyn/cm2 y 2 dyn/cm2) en un sistema de microfluidos de canal redondo 3D31. Estas condiciones de esfuerzo cortante se eligieron de acuerdo con los valores fisiológicos de esfuerzo cortante para la aorta y la vena cava informados a partir de datos in vivo 33. Las células se tiñeron usando lectina de aglutinina de germen de trigo (WGA), que se une a N-acetilglucosamina (GlcNAc) y ácido siálico ( Sia) residuos presentes dentro del glucocáliz endotelial. La tinción WGA se ha utilizado ampliamente para etiquetar, visualizar y cuantificar específicamente el glucocáliz en el endotelio vascular34,35. Como se muestra en la Fig. 1A-D, la tinción de WGA (GlcNAc, Sia) se observó principalmente en la tensión de cizallamiento laminar en las EC tanto arteriales como venosas. Por otro lado, el HS, el principal componente del glucocáliz expresado por las CE responsable de mantener las propiedades antiinflamatorias y anticoagulantes fisiológicas, dependía del flujo de las células arteriales (Fig. 1E, F), mientras que, sorprendentemente, el HS ya se observaba en condiciones estáticas. en la superficie de las CE venosas (Fig. 1G,H). Esto indica que la dinámica del glucocáliz difiere entre las células arteriales y venosas. Además, los cambios en el esfuerzo cortante influyeron en la distribución de HS. En condiciones de bajo cizallamiento (2 dyn/cm2), el HS se ubicó a lo largo de las regiones de unión de las EC, mientras que cuando se aplicó un alto esfuerzo de cizallamiento, el HS se agrupó en distintas áreas de la membrana celular (Fig. 1E, G). Se ha demostrado que la agrupación de proteoglicanos que contienen HS, como el sindecano-4, se produce en regiones específicas de la balsa lipídica de la membrana y es importante para el tráfico vesicular y la transducción de señales36.

Influencia de la tensión de cizallamiento en la cobertura de glicocalix/N-acetilglucosamina, ácido siálico y sulfato de heparán en células endoteliales arteriales y venosas. Imágenes representativas de canales de microfluidos que contienen células endoteliales porcinas arteriales (A,E) o venosas (C,G) cultivadas en condiciones estáticas, con tensión de cizallamiento baja (2 dyn/cm2) o alta (12 dyn/cm2). Las células se tiñeron (A,C) para N-acetilglucosamina (GlcNAc) y ácido siálico (Sia) en verde o (E,G) para sulfato de heparán (HS) en rojo. Los núcleos se muestran en azul (DAPI). Todas las imágenes fueron adquiridas con un microscopio confocal Zeiss LSM710. Barra de escala: 50 μm. (B,D,F,H) La cobertura de los componentes del glucocáliz (GlcNAc/Sia o HS) se calculó para cada imagen (4 imágenes/condición/experimento) como porcentaje de área positiva para (B,D) GlcNAc y Sia o (F ,H) para HS y se normalizó al número total de celdas/imagen. Los datos provienen de tres o más experimentos independientes y de 2 a 3 donantes de EC porcinos diferentes. Se utilizó ANOVA unidireccional con comparaciones múltiples para el análisis estadístico.

Para garantizar que las CE in vitro tengan un fenotipo similar al de las CE in vivo, se tiñeron la aorta torácica y la vena cava porcinas recién aisladas con marcadores de CE, como CD31 y vWF (factor de von Willebrand), y para el glucocáliz, tanto con WGA como con WGA. lectina y anticuerpo anti-HS. Como se muestra en la figura complementaria S1, las EC cultivadas in vitro muestran un fenotipo similar a las EC in vivo en los vasos sanguíneos.

Las alteraciones en el glucocáliz y el desprendimiento de HS provocan la pérdida de la unión a proteínas y se observan durante la lesión por reperfusión por isquemia y el trasplante. Actualmente, debido a la escasez mundial de órganos, el trasplante de órganos entre dos especies diferentes es muy considerado37.

Por lo tanto, para determinar si la diferencia en la dinámica del glucocáliz entre las células arteriales y venosas induciría respuestas distintas durante una condición inflamatoria como el xenotrasplante, las CE arteriales y venosas porcinas se perfundieron con suero humano normal (NHS) para imitar in vitro un entorno de xenotrasplante. Se ha demostrado que la unión de anticuerpos xenorreactivos preformados a xenoantígenos expresados ​​en la superficie de las CE, como la α-galactosa24, induce la eliminación del glucocáliz38 de las CE, lo que provoca el rechazo del injerto. Observamos el desprendimiento de HS de la superficie de las EC arteriales estimuladas con NHS (Fig. 2A, B; (-) y suero). Esto se correlacionó con una mayor expresión de E-selectina (Figura complementaria S2A; (-) y suero), una importante molécula de adhesión responsable en parte de la interacción de las CE con los leucocitos. Sorprendentemente, la estimulación de las CE venosas con NHS no indujo el desprendimiento de HS; Se observó una cobertura de HS del 16 al 18% en las EC activadas y no activadas (Fig. 2C, D; (-) y suero). Sin embargo, en cuanto a las EC arteriales, la expresión de selectina E aumentó después de la incubación con NHS (Fig. S2B complementaria). Para garantizar que el HS pueda desprenderse de la superficie de las células venosas, las CE se perfundieron con heparinasa I + III, una enzima que escinde específicamente el HS. Como se observa en las Fig. 2A,C, la incubación con heparinasa elimina aproximadamente el 50 % (Fig. 2B) y el 70 % (Fig. 2D) de HS de las células arteriales y venosas, respectivamente. Otros componentes del glucocáliz, como GlcNAc y ácido siálico, no se vieron afectados por el NHS (Figura complementaria S3A, B) ni, como se esperaba, por el tratamiento con heparinasa (Figura complementaria S3C).

La resistencia del desprendimiento de sulfato de heparán en células venosas activadas xenogénicas no previene la deposición de C3b/c. (A,C) Imágenes representativas de sulfato de heparán (HS) en la superficie celular de las células que no se trataron (-), perfundidas con suero humano normal al 10 % (suero) o 5 U/ml de heparinasa (heparinasa). HS se muestra en rojo y los núcleos en azul (DAPI). Barra de escala: 50 μm (B,D) Se cuantificó el desprendimiento de HS para cada imagen (4 imágenes/condición/experimento) como el porcentaje de área positiva para HS y se normalizó para el número total de células/imagen. (E,G) Imágenes representativas del depósito del complemento C3b/c en la superficie celular de las células que no se trataron (-), perfundidas con suero humano normal al 10 % (suero) o 5 U/ml de heparinasa (heparinasa). C3b/c se muestra en amarillo y los núcleos en azul (DAPI). Barra de escala: el depósito de C3b/c de 50 μm (F,H) se midió como el porcentaje de células positivas para C3b/c/número total de células/imagen (4 imágenes/condición/experimento). Los datos se cuantificaron con el software Fiji. Todas las imágenes fueron adquiridas con un microscopio confocal Zeiss LSM980. Los datos provienen de tres o más experimentos independientes y de 2 a 3 donantes de EC porcinos diferentes. Se utilizó ANOVA unidireccional con comparaciones múltiples para el análisis estadístico.

Para confirmar que nuestras observaciones no solo se limitan a EC cultivadas, se trataron criosecciones de aorta torácica y vena cava porcinas recién aisladas ex vivo con NHS y se analizó la cobertura de HS. Nuevamente, se observó el desprendimiento de HS de la arteria pero no de la vena (Fig. S4 complementaria). Además, para excluir posibles artefactos en la cobertura del glucocáliz debido a la fijación, se realizó tinción con GlcNAc/Sia en células vivas no fijadas. Como se muestra en la figura complementaria S5, la cobertura de GlcNAc/Sia es comparable en EC arteriales y venosas fijas y vivas en condiciones de tensión de cizallamiento bajo y alto. Además, para garantizar que la alta tensión de cizallamiento utilizada en la configuración experimental no interfiriera con el desprendimiento de HS de las EC venosas, que normalmente requieren un entorno de menor cizallamiento, la perfusión de NHS se realizó en condiciones de tensión de cizallamiento venoso (2 dyn/cm2) . Una vez más, el HS solo se eliminó de la superficie de las células arteriales (Fig. S6A-D complementaria).

El desprendimiento de HS se ha relacionado con un fenotipo EC proinflamatorio propenso a la deposición de complemento, la adhesión de leucocitos y la coagulación.

Se evaluó el depósito de complemento en las células tanto arteriales como venosas mediante inmunofluorescencia después de la perfusión de las células con NHS a una tensión de cizallamiento de 12 dyn/cm2. La elección de una tensión de cizallamiento más alta se basó en la observación de que el cizallamiento puede mejorar la expresión del receptor del complemento en las CE y permitir una mejor visualización de la deposición del complemento39. Las tres vías de la cascada del complemento activado se fusionan a nivel de C3, un componente esencial del sistema del complemento donde tiene lugar la amplificación de la señal40. Por lo tanto, la deposición de C3b/c, el producto de la escisión de C3 por las enzimas convertasa C3 del complemento, se usó como marcador para la activación del complemento. Curiosamente, aunque el desprendimiento del glucocáliz endotelial se observó solo en las células arteriales activadas por el NHS (Fig. 2A-D), se observó el depósito de complemento C3b/c en ambos tipos de células (Fig. 2E-H), lo que indica que la persistencia de HS en células venosas no protege contra el depósito de complemento. Para determinar si la eliminación de HS mejoraría la deposición del complemento, las células se trataron con heparinasa. La unión de C3b/c a las células arteriales y venosas no aumentó en comparación con las células estimuladas por NHS (Fig. 2E-H), lo que confirma que el HS en las células venosas no juega un papel en la regulación del depósito de complemento en una configuración de xenotrasplante.

Para investigar si el depósito de complemento en la superficie celular promueve la eliminación de HS, los canales se perfundieron con NHS inactivado por calor (suero HI). El calor bloquea la activación del sistema del complemento, por lo que solo se espera una mínima deposición de C3b/c. La incubación de células arteriales y venosas con NHS inactivado por calor no indujo el desprendimiento de HS (Figura complementaria S7A-D) y la deposición de C3b / c (Figura complementaria S7E-H). Esto demuestra que el desprendimiento de HS de las células arteriales podría reducirse significativamente inactivando el sistema del complemento, lo que sugiere que el depósito de complemento en las células arteriales se correlaciona con el desprendimiento de HS.

A continuación, evaluamos la unión de PBMC humanas a EC porcinas xenogénicas activadas. La adhesión de PBMC se cuantificó como el número de leucocitos que se unen a la superficie celular durante al menos 3 s. Se detectó una cantidad similar de unión de PBMC a las células arteriales y venosas (Fig. 3A-C). Como se muestra en la figura complementaria S2, la selectina E se expresa en las células arteriales y venosas después de la perfusión con NHS.

La persistencia del sulfato de heparán en las células venosas después de la activación xenogénica no previene la adhesión de leucocitos ni la formación de coágulos. (A,B) Imágenes representativas de 3 grabaciones de lapso de tiempo de la unión de células mononucleares de sangre periférica humana (PBMC; mostradas en verde) a (A) células endoteliales porcinas arteriales y (B) venosas que no se trataron (-) o se perfundieron con Suero humano normal al 10% (Suero) o 5 U/ml de heparinasa (Heparinasa). Los núcleos de las células se muestran en azul (Hoechst). Barra de escala: 50 μm. (C) Las PBMC adherentes se cuantificaron a partir de grabaciones de lapso de tiempo de 20 min de cuatro experimentos independientes mediante el conteo de células inmovilizadas durante ≧ 3 s. (D,E) Imágenes representativas de coágulos de fibrina (verde) que se forman en (D) CE arteriales o (E) venosas porcinas. Las células se dejaron sin tratar (-) o se perfundieron con suero humano normal al 10 % (suero) o 5 U/ml de heparinasa (heparinasa) antes de la adición de plasma humano citrado recalcificado enriquecido con fibrinógeno humano marcado con AlexaFluor488 (verde). Barra de escala: 200 μm. (F) El tiempo hasta la oclusión se determinó como oclusión completa del canal o desprendimiento de células y se cuantificó a partir de grabaciones de lapso de tiempo de los canales perfundidos con plasma. Los datos provienen de cuatro experimentos independientes, 2 o 3 donantes de EC porcinos diferentes y se analizaron con el software Fiji. Se utilizó ANOVA de dos vías con la prueba post-hoc de Tukey y Bonferroni para el análisis estadístico.

Para determinar si el desprendimiento de HS en ausencia de un estímulo inflamatorio provoca la unión de los leucocitos, las CE se trataron con heparinasa. La heparinasa no activa las EC, de hecho, no se expresó selectina E en la superficie celular de ninguno de los tipos de células (Fig. S2 complementaria). Inesperadamente, el desprendimiento de HS de las células arteriales tratadas con heparinasa pero no de las venosas fue suficiente para inducir la adhesión de las PBMC humanas (Fig. 3C). Esto indica que la expresión de E-selectina es esencial para la unión de los leucocitos a las EC venosas, mientras que el HS influye en la adhesión de las PBMC a las EC arteriales.

Luego analizamos el impacto del desprendimiento de HS en la formación de coágulos mediante la perfusión de células arteriales y venosas con plasma humano recalcificado enriquecido con fibrinógeno humano marcado con fluorescencia. Como se muestra en la Fig. 3D-F, el tiempo para la formación de coágulos de las EC tanto arteriales como venosas activadas con NHS se redujo en aproximadamente un 50 % y un 40 %, respectivamente, en comparación con las células no tratadas (Fig. 3F), lo que implica que el HS intacto en las venas las células no previene la coagulación. Curiosamente, las células arteriales no tratadas tuvieron un tiempo de formación de coágulos de 8 minutos, mientras que los canales que contenían células venosas ya se ocluían después de 5 minutos (Fig. 3F). Esto indica que existe una diferencia fundamental en el tiempo de coagulación entre estos dos tipos de células.

Para investigar más a fondo el papel de HS en la coagulación, las células se trataron con heparinasa antes de la perfusión con plasma humano enriquecido con fibrinógeno. Como se muestra en la Fig. 3D-F, mientras que el desprendimiento de HS redujo el tiempo hasta la oclusión de los canales sembrados con EC arteriales, no se observó ningún efecto en las células venosas. Esto sugiere que la eliminación de HS de las células arteriales es suficiente para inducir un fenotipo procoagulante.

Para determinar si las células venosas son resistentes al desprendimiento de HS también en diferentes condiciones proinflamatorias, estimulamos las CE con TNFα y LPS y medimos la cobertura de HS como se describe anteriormente. Se observó desprendimiento de HS para EC arteriales activadas con TNFα y LPS (Fig. 4A, B), pero nuevamente no para EC venosas activadas (Fig. 4C, D). De hecho, el HS se redujo en la superficie celular de las células arteriales tratadas con TNFα y LPS en un 41 % y un 30 % respectivamente, en comparación con el control (Fig. 4B), mientras que no se modificó en la superficie de las CE venosas (Fig. 4D).

El sulfato de heparán ileso en las células venosas después de la estimulación con TNFα o LPS evita el depósito del complemento. (A,C) Imágenes representativas de células sin tratar (-) o perfundidas con 100 ng/ml de TNFα, 100 μg/ml de LPS o 5 U/ml de heparinasa (heparinasa). El sulfato de heparán (HS) se muestra en rojo y los núcleos en azul (DAPI). Barra de escala: 50 μm. (B,D) El desprendimiento de HS se cuantificó para cada imagen (4 imágenes/condición/experimento) como el porcentaje de área positiva para HS y se normalizó para el número total de células/imagen. (E,G) Imágenes representativas del complemento C3b/c en la superficie celular de las células que no se trataron (-) o se perfundieron con 100 ng/ml de TNFα, 100 μg/ml de LPS o 5 U/ml de heparinasa (heparinasa). C3b/c se muestra en amarillo y los núcleos en azul (DAPI). Barra de escala: el depósito de C3b/c de 50 μm (F,H) se midió como el porcentaje de células positivas para C3b/c/número total de células/imagen (4 imágenes/condición/experimento). Se utilizó ANOVA de dos vías con la prueba post-hoc de Tukey y Bonferroni para el análisis estadístico. Los datos provienen de tres o más experimentos independientes, 2 o 3 donantes de EC porcinos diferentes y se analizaron con el software Fiji.

Para evaluar si la persistencia de HS en la superficie de EC permitiría que las células mantuvieran un fenotipo antiinflamatorio, las EC se perfundieron con suero porcino normal (NPS) y se evaluó la deposición de complemento. Como se observa en la Fig. 4E-H, se detectó una pequeña cantidad de C3b/c en la superficie de las EC no estimuladas. Esto probablemente se deba al desajuste inmunológico entre las EC y las NPS obtenidas de diferentes donantes. La estimulación de las células arteriales con TNFα o LPS aumentó la deposición de C3b/c en aproximadamente un 25 % y un 30 %, respectivamente (Fig. 4F), lo que confirma que el desprendimiento de HS de las células arteriales se correlaciona con una pérdida de propiedades antiinflamatorias. Por otro lado, la perfusión de células venosas activadas con TNFα o LPS con NPS no condujo al depósito de complemento (Fig. 4H), lo que sugiere que en estas afecciones inflamatorias, el HS en las células venosas es protector. Para confirmar aún más el papel protector de HS, tanto las CE arteriales como las venosas se perfundieron con heparinasa. Como se muestra en la Fig. 4, la eliminación enzimática de HS por heparinasa (Fig. 4A-C) de la superficie celular fue suficiente para inducir la deposición de C3b/c en las EC tanto arteriales como venosas (Fig. 4F,H).

A continuación, investigamos si la diferencia observada en la dinámica de HS entre las células arteriales y venosas activadas por TNFα y LPS afectaría su interacción con los leucocitos. Para ello, se perfundieron EC arteriales y venosas activadas con TNFα o LPS con PBMC porcinas marcadas con fluorescencia. Se observó un aumento de la unión de PBMC para las EC arteriales y venosas activadas (Fig. 5A-C). Esto se correlacionó con la expresión de la superficie celular de E-selectina (Fig. S2B complementaria). En conjunto, esto sugiere que aunque el HS no se desprende de la superficie de las CE venosas (Fig. 2C, D), la mayor expresión de E-selectina es suficiente para permitir la adhesión de PBMC. De hecho, el desprendimiento de HS por heparinasa antes de la perfusión de PBMC en células venosas no aumentó la adhesión de PBMC, mientras que en las células arteriales, la eliminación de HS sin activación previa fue suficiente para inducir la unión de PBMC (Fig. 5A, C).

El sulfato de heparán intacto en las células endoteliales venosas activadas por TNFα o LPS no impide la adhesión de los leucocitos, pero protege contra la formación de coágulos. (A,B) Imágenes representativas de tres grabaciones de lapso de tiempo de la unión de células mononucleares de sangre periférica porcina (PBMC; mostradas en verde) a (A) células endoteliales porcinas arteriales y (B) venosas que no se trataron (-) o se perfundieron con 100 ng/ml de TNFα, 100 μg/ml de LPS o 5 U/ml de heparinasa (Heparinasa). Los núcleos de las células se muestran en azul (Hoechst). Barra de escala: 50 μm. (C) Las PBMC adherentes se cuantificaron a partir de grabaciones de lapso de tiempo de 20 min de cuatro experimentos independientes mediante el conteo de células inmovilizadas durante ≧ 3 s. (D,E) Imágenes representativas de coágulos de fibrina (verde) que se forman en (D) células endoteliales porcinas arteriales o (E) venosas. Las células se dejaron sin tratar (-) o se perfundieron con 100 ng/ml de TNFα, 100 μg/ml de LPS o 5 U/ml de heparinasa (heparinasa). Los núcleos de las células se muestran en azul (Hoechst). Barra de escala: 200 μm. (F) El tiempo hasta la oclusión se determinó como oclusión completa del canal o desprendimiento de células y se cuantificó a partir de grabaciones de lapso de tiempo de canales perfundidos con plasma enriquecidos con fibrinógeno marcado con AlexaFluor488 (verde). Los datos provienen de cuatro experimentos independientes, 2 o 3 donantes de EC porcinos diferentes y se analizaron con el software Fiji. (C) ANOVA bidireccional con prueba post-hoc de Tukey y Bonferroni o (F) ANOVA unidireccional con comparaciones múltiples para el análisis estadístico.

Dado que la persistencia de HS en las células venosas después de la estimulación con TNFα o LPS pudo proteger contra la deposición del complemento, investigamos si la formación de coágulos también se vería afectada. Para esto, las células venosas y arteriales se dejaron sin tratar o se activaron con TNFα, LPS o heparinasa y luego se perfundieron con plasma porcino combinado normal recalcificado enriquecido con fibrinógeno marcado con fluorescencia AlexaFluor488. Como se muestra en la Fig. 5D-F, el tiempo de formación del coágulo se redujo solo para las CE arteriales pero no para las venosas (Fig. 5F). Esto indica que el HS en las células venosas participa en el mantenimiento de un estado anticoagulante. Sin embargo, dado que la heparinasa no conduce a un aumento de la formación de coágulos, estos datos sugieren que son necesarios otros efectos, como el daño a la capa endotelial o la inducción de la expresión del factor tisular procoagulante, para promover la trombosis venosa.

Se ha observado desprendimiento del glucocáliz endotelial en muchas afecciones inflamatorias18,22,23,27, sin embargo, se desconoce en gran medida el efecto de la inflamación en las células arteriales o venosas y el resultado en términos de alteración del glucocáliz. Aquí, mostramos que el glucocáliz en las CE venosas y arteriales responde de manera diferente tanto a la tensión de cizallamiento como a las señales inflamatorias. Se sabe que el esfuerzo cortante influye en el desarrollo del glucocáliz41,42,43,44,45. El flujo reducido o alterado en las células arteriales no solo está relacionado con un fenotipo proaterogénico que favorece la aterosclerosis46,47,48, sino también con un grosor reducido del glucocáliz49 que afecta la función del glucocáliz y causa inflamación y coagulación. Encontramos que hay distintas dinámicas de glucocáliz, en particular para HS, en EC arteriales y venosas porcinas bajo diferentes condiciones de esfuerzo cortante. El HS en las células arteriales solo se expresa bajo flujo, mientras que en las células venosas está presente incluso en condiciones estáticas (fig. 1). Hemos investigado la expresión de las cadenas laterales de glicosaminoglicanos (GAG), sin embargo, aún no está claro cómo influye la tensión de cizallamiento en las proteínas centrales, que son los puntos de anclaje para las diferentes cadenas laterales de GAG. Es posible que las proteínas del núcleo expresadas en condiciones estáticas estén decoradas con un conjunto diferente de unidades de disacárido N-sustituidas (teñidas por anticuerpos anti-HS) y N-no sustituidas (teñidas por WGA-Lectin) que bajo flujo, lo que explica la presencia de HS pero baja expresión de GlcNAc/Sia en CE venosos en condiciones estáticas. Se necesita más investigación para investigar las proteínas centrales además de las cadenas laterales GAG específicas en condiciones estáticas y de flujo. Además, la distribución de HS en la superficie celular está influenciada por cambios en el esfuerzo cortante. El HS se agrupa en regiones específicas de la membrana celular en condiciones de alto cizallamiento, mientras que se distribuye a lo largo de las uniones celulares en condiciones de bajo cizallamiento (Fig. 1). Zeng et al.41 observaron la redistribución de los componentes del glucocáliz como el sindecan-4 a las balsas lipídicas y se sugirió que permitía la agregación de moléculas de señalización e inducía la transducción de señales. Curiosamente, también se demostró que el agrupamiento de HS en regiones de membrana de unión ricas en lípidos facilita la entrada del virus SARS-CoV 2 en las células huésped50. Por lo tanto, las variaciones en la distribución de HS en EC arteriales o venosas podrían determinar una predisposición diferente a la activación celular o infección viral.

La dinámica del glucocáliz entre las células arteriales y venosas también difiere con la activación de la CE. De acuerdo con estudios previos22,23,25,26,51,52,53, observamos el desprendimiento de HS de la superficie celular de células arteriales estimuladas con suero humano normal, TNFα y LPS. Sorprendentemente, el HS en las células venosas no se vio afectado (Figs. 2, 3), lo que sugiere que el HS en las CE venosas es menos susceptible al desprendimiento o está protegido contra el desprendimiento. El desprendimiento del glucocáliz está mediado en gran medida por las metaloproteinasas de la matriz (MMP) que están reguladas al alza en las EC23 activadas por TNFα y durante la sepsis, entre otras afecciones inflamatorias54. La actividad de las MMP está controlada fisiológicamente por los inhibidores tisulares de las metaloproteinasas de la matriz (TIMP), que también aumentan durante la inflamación55. Aunque la expresión sin cambios de MMP y/o la actividad mantenida de TIMP en células venosas pero no arteriales podría explicar la susceptibilidad diferencial a la eliminación, no observamos cambios en la expresión de MMP2 y TIMP1 después de la activación con suero humano, TNFα o LPS (datos no mostrada). Se necesita más investigación para analizar la expresión de otras MMP y TIMP e identificar el mecanismo detrás de la resistencia del glicocálix endotelial venoso al desprendimiento.

La persistencia del HS en las CE venosas activadas implica que tras la activación endotelial se conservan las propiedades antiinflamatorias y anticoagulantes. Esto hace que las venas sean potencialmente más resistentes al daño vascular que las arterias. De hecho, demostramos que las células arteriales tienen un fenotipo antiinflamatorio y anticoagulante dependiente de HS, mientras que el HS conservado en las células venosas conduce a resultados funcionales variables cuando se comparan diferentes estímulos inflamatorios. El HS en las células venosas protegió contra el depósito de complemento y la coagulación solo cuando se usó TNFα o LPS para la activación endotelial (Figs. 4, 5). Este papel protector de HS no se observó cuando se empleó una configuración de xenotrasplante (Figs. 2, 3). Esto podría deberse a la presencia simultánea de múltiples estímulos inflamatorios durante un entorno de xenotrasplante que provocan una fuerte reacción inflamatoria. De hecho, Wünsch et al.56 demuestran que las CE arteriales porcinas producen una respuesta sostenida de calcio intracelular al suero humano en comparación con las citocinas proinflamatorias clásicas.

Si bien las diferencias en el depósito del complemento en las EC arteriales y venosas dependían del estímulo inflamatorio, la adhesión de PBMC se produjo de forma consistente en ambos tipos de células (Figs. 3, 5). La unión de PBMC a las células venosas se correlacionó con la expresión de la superficie celular de E-selectina (Fig. S2 complementaria), mientras que, curiosamente, también se observó la adhesión a las células arteriales en condiciones no inflamatorias en las que el HS simplemente se eliminó de la superficie celular mediante el tratamiento con heparinasa. Esto sugiere que el desprendimiento de HS de las células arteriales es suficiente para inducir la adhesión de los leucocitos. Se desconoce si el tratamiento con heparinasa en las células arteriales expone moléculas de adhesión adicionales distintas de la E-selectina.

La importancia del desprendimiento de glucocáliz para la adhesión de leucocitos ha sido un tema de debate. Por un lado, un glucocáliz intacto puede protegerse de las selectinas y evitar la unión de los leucocitos, ya que el grosor del glucocáliz intacto normalmente supera la longitud de las moléculas de adhesión57. Por otro lado, el glucocáliz secuestra quimiocinas para mantener concentraciones locales elevadas y favorecer el reclutamiento de leucocitos58. Dado que la adhesión y la extravasación de leucocitos generalmente ocurren en las vénulas59, sugerimos que las CE venosas podrían mantener activamente su glucocáliz para favorecer el secuestro de quimiocinas y mediar en el reclutamiento de leucocitos durante la inflamación. Se necesitarían estudios que incluyan quimiocinas y estímulos inflamatorios para probar esta hipótesis. Por el contrario, el desprendimiento de HS en las CE arteriales podría reducir el grosor del glucocáliz y, por lo tanto, exponer las moléculas de adhesión que conducen a una mayor adhesión de los leucocitos. Curiosamente, McDonald et al.17 muestran que la eliminación enzimática del glucocáliz de EC arteriales cultivadas en flujo, incluso sin un estímulo inflamatorio, aumentó la expresión de ICAM-1 y la adhesión de leucocitos. Esto sugiere que el desprendimiento de HS podría no solo reducir el grosor del glucocáliz, sino también conducir a una mayor expresión de moléculas de adhesión en las CE arteriales. Sin embargo, para los vasos venosos, se demostró que la unión de los glóbulos blancos se produjo sin desprendimiento del glucocáliz después de un estímulo inflamatorio60. Esto sugiere que factores adicionales al grosor del glucocáliz podrían desempeñar un papel, siendo un ejemplo la densidad del glucocáliz. Platts et al.61 sugieren que hay un "aflojamiento" del glucocáliz de la vénula poscapilar después de la lesión por isquemia/reperfusión, lo que permite que el tinte fluorescente penetre más cerca de la capa de CE. Este fenómeno también podría aplicarse a los leucocitos circulantes. Un glucocáliz más "suelto" en las CE venosas podría permitir que las PBCM se unan incluso con un glucocáliz intacto. Nuestros datos sobre la cobertura del glucocáliz muestran una cobertura más baja en las células venosas que en las arteriales, lo que sugiere que el glucocáliz venoso es menos denso y posiblemente más permisivo para la adhesión de leucocitos. En las CE arteriales, donde la cobertura del glucocáliz es más densa, es probable que el desprendimiento exponga las moléculas de adhesión responsables de la unión de los leucocitos.

También se sabe que el desprendimiento de glicocalix induce un fenotipo EC procoagulante. De hecho, observamos que el desprendimiento de HS de las células arteriales aumenta la formación de coágulos (Figs. 3, 5). Nuevamente, el tratamiento con heparinasa fue suficiente para inducir este fenotipo EC procoagulante. Por el contrario, en las CE venosas, donde se conservó HS, la coagulación se observó solo después de la activación xenogénica mientras que no ocurrió después de la estimulación con TNFα o LPS (Figs. 3, 5). Aunque las citocinas proinflamatorias y las endotoxinas se consideran protrombóticas62,63, el TNFα no induce directamente la trombosis venosa64,65. Los ratones knock-out para el receptor TNFα también desarrollan trombos después de la ligadura de la vena cava inferior65. Esto sugiere que los cambios en la expresión superficial de las proteínas protrombóticas, como el factor tisular, en lugar de las citocinas proinflamatorias, podrían provocar la trombosis venosa66.

En conjunto, nuestros hallazgos indican que las células arteriales son más susceptibles al desprendimiento de HS. De hecho, la eliminación de HS de la superficie de las células arteriales es suficiente para iniciar una respuesta inflamatoria y trombótica. En cambio, las células venosas, en las que se mantiene el HS, requieren "golpes" adicionales además del desprendimiento del glucocáliz para perder su fenotipo antiinflamatorio y anticoagulante. Por lo tanto, esto sugiere que las EC venosas, en comparación con las EC arteriales, son potencialmente más resistentes a las agresiones inflamatorias. Se deben considerar enfoques terapéuticos distintos para diferentes tipos de células: mientras que la reposición de HS desprendida sería beneficiosa para las EC arteriales, se deben considerar otros enfoques que no apunten a la recuperación del glucocáliz para las EC venosas. Se necesita más investigación para comprender el mecanismo detrás de la resistencia al desprendimiento de HS venoso.

Si bien los sistemas de microfluidos están ganando popularidad para la investigación in vitro, es importante mencionar que dichos sistemas aún pueden diferir de la situación in vivo. También se debe agregar que la investigación descrita anteriormente se centró en las CE macrovasculares, pero también se deben analizar las CE microvasculares y específicas de órganos para ampliar el conocimiento actual sobre la heterogeneidad de la dinámica del glucocáliz.

Todos los datos relevantes están contenidos en el manuscrito.

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La microscopía confocal y de fluorescencia se realizó en un equipo respaldado por el Microscopy Imaging Center (MIC) de la Universidad de Berna, Suiza.

Este trabajo fue financiado por la Fundación Nacional de Ciencias de Suiza (SNSF), Subvención No. 310030_182264.

Departamento de Investigación Biomédica (DBMR), Universidad de Berna, Murtenstrasse 24, 3008, Berna, Suiza

Anastasia Milusev, Alain Despont, Jane Shaw, Robert Rieben y Nicoletta Sorvillo

Escuela de Graduados en Ciencias Biomédicas y Celulares (GCB), Universidad de Berna, Berna, Suiza

Anastasia Milusev

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AM fue responsable de la conceptualización, la curación de datos, el análisis formal, la investigación, la metodología, la visualización y redacción del borrador original, así como la revisión y edición. NS fue responsable de la supervisión y ayudó con la conceptualización, la redacción del borrador original, así como la revisión y edición. RR fue responsable de financiar la adquisición y los recursos y ayudó con la revisión y edición. AD y JS ayudaron con la investigación.

Correspondencia a Nicoletta Sorvillo.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Reimpresiones y permisos

Milusev, A., Despont, A., Shaw, J. et al. Los estímulos inflamatorios inducen la eliminación de sulfato de heparán de las células endoteliales porcinas arteriales pero no de las venosas, lo que conduce a respuestas proinflamatorias y procoagulantes diferenciales. Informe científico 13, 4483 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-31396-z

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Recibido: 12 diciembre 2022

Aceptado: 10 de marzo de 2023

Publicado: 18 de marzo de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-31396-z

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